基因2b亞型豬流行性腹瀉病毒變異株的分離鑒定和疫苗研制.pdf

1、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)是豬流行性腹瀉(PED)的致病因子，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害巨大。自2010年12月以來，中國各地豬群中暴發(fā)大規(guī)模的腹瀉疾病，其特征是水性腹瀉、嘔吐、脫水和乳豬高死亡率。研究表明，該疫病是由強(qiáng)毒力的基因2b亞型（G2b亞型）PEDV變異株引起，該型毒株與經(jīng)典疫苗株之間存在較大的抗原性差異，導(dǎo)致免疫保護(hù)效果不理想，因此迫切需要研制相應(yīng)的疫苗用于該疫病的防控。
　　本研究從江蘇某規(guī)?；i場急性腹瀉的哺乳仔豬小腸樣品中分

2、離到1株P(guān)EDV（命名為JSX2014株），該毒株通過細(xì)胞傳代適應(yīng)之后可在Vero細(xì)胞上穩(wěn)定增殖并產(chǎn)生細(xì)胞病變(CPE)。采用RT-PCR方法對(duì)JSX2014株的全基因進(jìn)行擴(kuò)增并測序，運(yùn)用MEGA5.05軟件分析比較JSX2014株與其他PEDV毒株的全基因序列及S基因序列遺傳進(jìn)化關(guān)系，表明JSX2014毒株屬于當(dāng)前流行的G2b亞型。
　　本研究檢測了G2b亞型PEDV JSX2014毒株在Vero細(xì)胞上以不同接毒量及接毒后不同時(shí)

3、間點(diǎn)的病毒滴度，以確定該毒株的細(xì)胞適應(yīng)毒株增殖規(guī)律。針對(duì)PEDV的N基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立實(shí)時(shí)熒光定量方法，對(duì)增殖的JSX2014毒株進(jìn)行定量。根據(jù)《中國獸藥典》和《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》要求建立了JSX2014毒株的種子庫，經(jīng)RT-PCR檢測未見外源病毒污染。利用Vero細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝增殖JSX2014毒株抗原，濃縮后經(jīng)甲醛滅活，添加氫氧化鋁佐劑，制備了滅活疫苗。用該滅活疫苗免疫產(chǎn)前母豬及50日齡斷奶仔豬，利用間接E

4、LISA方法和血清中和試驗(yàn)分別檢測疫苗免疫后的抗體消長規(guī)律。間接ELISA試驗(yàn)顯示，斷奶仔豬于免疫后14d已開始產(chǎn)生特異性抗體，免疫后42d表現(xiàn)100％血清抗體轉(zhuǎn)陽。以JSX2014作為指示病毒進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)，顯示接種滅活JSX2014疫苗的斷奶仔豬于免疫后42天表現(xiàn)最高血清抗體水平，與間接ELISA檢測抗體增長規(guī)律相一致。免疫母豬分娩后7天的血清、初乳樣品的中和抗體效價(jià)明顯高于G1a型CV777毒株制備的滅活疫苗免疫組。綜合所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果