稻瘟病菌Rab蛋白的定位與生化功能分析.pdf

1、稻瘟病是世界性的水稻重要病害之一，該病發(fā)生直接關系到世界各國糧食安全。其病原稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）已成為研究絲狀真菌生長發(fā)育和侵染致病機制的重要模式生物，其侵染過程錯綜復雜，包括分生孢子的萌發(fā)、附著胞的形成和分化、穿透寄主組織后定殖和擴展等過程，涉及到諸多膜運輸、信號轉導和蛋白轉運等復雜的生理活動。研究表明，胞吞作用與稻瘟病致病性相關。
　　Rab蛋白作為分子開關，在胞吞、胞吐和貨物循環(huán)途徑等過程中發(fā)揮了

2、重要的作用。每一個 Rab都能靶定到一個特異的細胞器上，通過其上游調控因子和下游特定的效應子的輔助，實現(xiàn)活性態(tài)GTP結合形式和失活態(tài)GDP結合形式的循環(huán)，進而調控著囊泡運輸?shù)母鱾€過程。稻瘟病菌中含有11個假定的Rab蛋白，本研究在哺乳動物細胞中克隆并表達了其中6個假定 Rab蛋白 MoRab1、MoRab8、MoRab11、MoYpt7、MoRab5A和MoRab5B，并檢測了這些Rab蛋白在細胞內的定位。鑒于MoRab5B是稻瘟病菌侵

3、染致病所必需的，而 MoRab5A敲除突變體是致死的，本研究深入地分析了MoRab5A和MoRab5B的生化特性和功能特點。結果發(fā)現(xiàn)MoRab5A和MoRab5B都能與人類Rab5（hRab5）共定位于細胞內的早期內涵體上。同樣地，MoRab1、MoRab8、MoRab11分別與其相應的 hRabs定位于內質網(wǎng)、內吞囊泡和循環(huán)囊泡，表明它們確實是哺乳動物中相應 Rabs的直系同源物。相反，MoYpt7彌散地分布在細胞內，可能因其轉錄后的

4、異戊二烯化和靶定到晚期內涵體膜上的過程受阻。
　　此外，與hRab5類似，MoRab5A和MoRab5B在GTP活性態(tài)時與Rab5的一些效應因子結合，包括EEA1、Rabenosyn-5和Rabaptin-5。然而GST pull-down實驗顯示，MoRab5A:WT（野生型）和MoRab5A:CA（持續(xù)激活突變體）都能與效應因子相互作用，且作用強度相同，表明 MoRab5A在 GTP水解中可能存在缺陷，在細胞中大部分以GTP形

5、式存在。GTP水解實驗證實了MoRab5A的GTP酶活性比MoRab5B和hRab5低很多，而且對RabGAP5的促進作用也不敏感。進一步分析了MoRab5A和MoRab5B的嵌合體和突變體，結果表明，MoRab5A在Switch I區(qū)域含有Pro殘基，是其區(qū)別于MoRab5B和hRab5的關鍵位點。MoRab5A和MoRab5B在細胞中的功能也是不同的。盡管兩者都能靶定到早期內涵體上，但是只有MoRab5B和hRab5一樣，促進了早期

6、內涵體的融合以及液相內吞作用，并在NGF誘導的神經(jīng)突觸的生長過程中發(fā)揮了負調控的作用。相反，MoRab5A則與另一個早期內涵體成員Rab22的結構相似，在分子開關I區(qū)域都含有Pro氨基酸并阻礙了GTP酶的活性。我們的結果鑒定出MoRab5B是Rab5的直系同源物，暗示了MoRab5A在內涵體的分選過程中特異地發(fā)揮了非冗余的功能。
　　綜上所述，在稻瘟病菌中，從真核生物最后的祖先（LECA）到哺乳動物的進化過程中，MoRab5B和M