稻瘟病菌細(xì)胞自噬相關(guān)基因MgATG4表達(dá)模式與功能分析.pdf

1、細(xì)胞自噬是真核生物中高度保守的過(guò)程，在此過(guò)程中，包括過(guò)?；虍惓５募?xì)胞器在內(nèi)的細(xì)胞物質(zhì)被包裹進(jìn)雙層膜的自噬泡中并被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w或液泡中進(jìn)行降解，從而使得生物大分子得以重新利用。細(xì)胞自噬在諸如對(duì)變化環(huán)境的適應(yīng)、發(fā)育與分化過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)的建成以及細(xì)胞壽命的決定等一系列生物事件中起著重要作用。細(xì)胞自噬相關(guān)基因最早在酵母中被鑒定，如今在所有的高等生物中已發(fā)現(xiàn)其同源基因。細(xì)胞自噬可由饑餓誘導(dǎo)產(chǎn)生并維持一個(gè)氨基酸庫(kù)以便合成一些必需的蛋白質(zhì)。
　

2、　 稻瘟病是一種由稻瘟病菌引起的毀滅性病害，給全世界的水稻生產(chǎn)帶來(lái)巨大威脅。稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)具有典型的生活史和侵染循環(huán)，且被認(rèn)為是絲狀真菌分子生物學(xué)和病原菌與寄主互作研究的模式生物。稻瘟病菌能夠形成專門的侵染結(jié)構(gòu)—附著胞，其能夠產(chǎn)生巨大的胞內(nèi)膨壓(約8.0Mpa)，這個(gè)壓力使稻瘟病菌穿透植物葉片表皮并侵染寄主。
　　 本研究主要目的是闡明細(xì)胞自噬相關(guān)基因MgATG4的表達(dá)模式，細(xì)胞自噬與稻瘟病菌

3、生長(zhǎng)、發(fā)育和致病性之間的關(guān)系以及細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白MgATG4與MgATG8之間的相互作用。獲得的主要研究結(jié)果如下：
　　 從稻瘟病菌成熟附著胞的差減文庫(kù)中克隆到了細(xì)胞自噬相關(guān)基因MgATG4，該基因編碼一個(gè)53.93kDa的半胱氨酸蛋白酶。將稻瘟病菌MgATG4基因，互補(bǔ)到酵母ATG4基因缺失突變體中，能夠恢復(fù)酵母的細(xì)胞自噬過(guò)程；對(duì)MgATG4進(jìn)行時(shí)間表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)該基因在孢子、附著胞及菌絲中均有表達(dá)；細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)MgA

4、TG4蛋白在細(xì)胞質(zhì)中均勻表達(dá)。
　　 通過(guò)構(gòu)建MgATG4基因置換載體，得到MgATG4基因缺失突變體△mgatg4。△mgatg4突變體在CM培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)發(fā)生變化，菌絲稀疏；產(chǎn)孢量顯著下降，約為野生型Guyll的1/90；分生孢子的萌發(fā)及附著胞形成延遲；附著胞膨壓顯著下降，在完整的水稻或者大麥葉片上不能形成可見(jiàn)病斑，致病性喪失；在有磨損的大麥葉片上也未能產(chǎn)生病斑；突變子在OMA培養(yǎng)基上與2539菌株交配，能產(chǎn)生-了囊殼，

5、但延遲且量極少；基因MgATG4的缺失，使細(xì)胞自噬過(guò)程中斷，液泡和細(xì)胞質(zhì)中無(wú)自噬泡的積累。
　　 從稻瘟病菌成熟附著胞的差減文庫(kù)中克隆得到了另一個(gè)細(xì)胞自噬相關(guān)基因MgATG8，該基因編碼一個(gè)14.4kDa的ATG8蛋白。對(duì)MgATG8進(jìn)行時(shí)間表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)該基因在孢子、附著胞及菌絲中均有表達(dá)。通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)檢測(cè)MgATG4與MgATG8在稻瘟病菌細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的相互作用，分別構(gòu)建BiFC載體ATG4-YFPN、ATG

6、4△-YFPN和YFPC-ATG8共轉(zhuǎn)化稻瘟病菌Guyll菌株并用潮霉素和草胺磷雙抗篩選。轉(zhuǎn)化子BY-7經(jīng)共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在孢子、營(yíng)養(yǎng)菌絲、附著胞形成過(guò)程及穿透過(guò)程中均沒(méi)有檢測(cè)到Y(jié)FP熒光信號(hào)，但在饑餓誘導(dǎo)4h后的菌絲中檢測(cè)到了MgATG4與MgATG8的相互作用。
　　 MgATG4蛋白序列中含有6個(gè)半胱氨酸殘基。通過(guò)序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)MgATG4蛋白序列中的Cys206為保守半胱氨酸；分別構(gòu)建MgATG4、MgATG