稻瘟病菌mnh6和mtp1基因的克隆和功能分析.pdf

1、稻瘟病是一種嚴重危害水稻的毀滅性病害，其病原菌為子囊菌Magnaporthe grisea。稻瘟病菌也是一種研究病原真菌一寄主植物相互作用的模式生物。研究稻瘟病菌致病的分子機理不僅對于了解病原真菌一寄主的互作機理，而且對于開發(fā)新的殺菌劑具有重要的促進作用。稻瘟病菌致病相關基因的克隆和功能分析是研究稻瘟病菌致病機制的一種快速且有效的途徑。非組蛋白基因6(rank6)和Ⅲ型膜整合蛋白(mtpl)是稻瘟病菌的兩個功能未知的基因。目前為止，還沒

2、有在稻瘟病菌或其他絲狀真菌中研究過mnh6和mtpl基因或其同源基因的功能。本文克隆了mnh6和mtpl基因，通過DNA同源置換分別敲除了這2個基因，并分析了基因缺失引起的稻瘟病菌表型和致病性變化，確定了這2個基因在稻瘟病菌生長、發(fā)育和致病過程中的部分功能。 主要研究結果如下： 1．利用長距離PCR從稻瘟病菌附著胞eDNA文庫中克隆了mnh6和mtpl基因的eDNA序列，并從基因組DNA中克隆了mnh6和mtpl基因的全

3、長DNA序列。 2．使用多種分析軟件，分析和預測了MNH6和MTP1蛋白的結構和功能。MNH6為非組蛋白(DNA結合蛋白)，屬于HMGB蛋白家屬。MTP1為一種Ⅲ型膜整合蛋白，具有8個跨膜區(qū)，可能結合在細胞膜上。 3．通過構建基因敲除載體和原生質體轉化，分別獲得了mnh6缺失或mtpl缺失的基因缺失突變子，并從DNA水平和RNA水平進行了驗證。 4．突變子△mnh6的菌落形態(tài)不同于野生型GUYll，菌落呈灰白色，

4、菌絲稀疏，生長速度變慢，產(chǎn)孢菌絲細胞壁的溶劑疏水性消失，菌絲細胞壁容易被細胞壁降解酶降解，產(chǎn)孢減少，孢子形態(tài)變得細長，孢子的附著胞形成率降低，附著胞的膨壓降低，附著胞對寄主植物表面的穿透能力減弱，侵入后生長速度減慢，噴霧接種后對大麥和水稻C039的致病性消失。mnh6基因重新引入△mnh6后，突變子的表型恢復。 5．MNH6-GFP融合蛋白主要在細胞核內(nèi)表達，說明MNH6蛋白的作用位點主要在細胞核內(nèi)。MNH6在稻瘟病菌致病循環(huán)過

5、程中的各個發(fā)育時期具有重要作用，如菌絲生長，產(chǎn)孢，附著胞形成，穿透，侵入生長等時期，表明MNH6是稻瘟病菌致病性和完成侵染循環(huán)所必需的。 6．突變子△mtpl的菌落形態(tài)類似于野生型Guyll，但菌絲顏色較黑，產(chǎn)孢減少，孢子萌發(fā)延遲，附著胞形成延遲，離體接種發(fā)現(xiàn)突變子對大麥和水稻C039的致病性與野生型一致。突變子△mtpl在各種培養(yǎng)基上的生長速度與野生型沒有差異，兩者附著胞膨壓也沒有區(qū)別。 7．mtpl啟動子指導的GFP