低溫敏感植物白銀豆中三個(gè)脂肪酸去飽和酶基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、植物對(duì)低溫的敏感程度與其起源地密切相關(guān),并且起源于溫帶的植物經(jīng)過(guò)低溫冷馴化后可以獲得一定的抗冷能力,而起源于熱帶亞熱帶的植物卻普遍缺乏這樣的能力。白銀豆(Phaseolus lunatus L.)則是起源于熱帶美洲的豆科棉豆屬植物。
　　 大量實(shí)驗(yàn)證明膜脂的不飽和度與植物的冷適應(yīng)性關(guān)系密切,抗冷植物比冷敏感植物的膜脂肪酸不飽和度高。生物膜磷脂的脂肪酸組成及不飽和度直接取決于脂肪酸去飽和酶的種類和數(shù)量,.通過(guò)酶的種類和活性的變化,

2、調(diào)節(jié)膜脂的不飽和度進(jìn)而改變其流動(dòng)性,以適應(yīng)外界溫度的變化。本研究對(duì)白銀豆進(jìn)行抗冷性鑒定,并克隆了3個(gè)脂肪酸去飽和酶基因,分析了低溫等逆境脂肪酸去飽和基因的表達(dá)情況,為進(jìn)一步研究脂肪酸去飽和酶基因的功能以及在植物抵抗低溫等非生物逆境中的作用打下基礎(chǔ)。
　　 1.通過(guò)表型觀察以及用膜相對(duì)電解質(zhì)滲漏率做Arrhenius圖,得到白銀豆幼苗生長(zhǎng)臨界低溫為8±1℃。對(duì)白銀豆幼苗進(jìn)行8℃低溫處理,研究不同脅迫時(shí)間下葉片中各生理生化指標(biāo)的應(yīng)激

3、動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明在臨界生長(zhǎng)低溫下,白銀豆幼苗的生長(zhǎng)受到一定的影響,但是通過(guò)增加體內(nèi)氧化酶活性等能在一定程度上抵御8℃低溫產(chǎn)生的影響。
　　 2.利用同源序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,先通過(guò)RT-PCR的方法從白銀豆葉片中克隆到各脂肪酸去飽和酶基因的保守區(qū)域,然后根據(jù)基因片段設(shè)計(jì)RACE引物,利用RACE技術(shù)克隆各基因末端序列,拼接得到3個(gè)脂肪酸去飽和酶基因cDNA全長(zhǎng)序列。同時(shí),根據(jù)全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)分段引物,以基因組DNA為模板分段克隆,拼接

4、獲得各基因DNA水平全長(zhǎng)序列。其中SAD(硬脂酰-ACP去飽和酶)cDNA全長(zhǎng)為1777 bp,ORF為1317 bp,編碼439個(gè)氨基酸,DNA全長(zhǎng)為1939 bp,包含有一個(gè)內(nèi)含子。與大豆SAD同源性為86％,但是在進(jìn)化關(guān)系上,白銀豆與麻瘋樹的SAD親緣關(guān)系最近。FAD3 cDNA全長(zhǎng)1510 bp,ORF為1116 bp,編碼372個(gè)氨基酸,DNA全長(zhǎng)為2663 bp,包含有7個(gè)內(nèi)含子。預(yù)測(cè)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)FAD3,負(fù)責(zé)催化亞油酸脫氫生成

5、油酸,與大豆中FAD3同源性達(dá)91％。白銀豆FAD2 cDNA全長(zhǎng)為1652 bp,ORF為1059 bp,編碼353個(gè)氨基酸,DNA全長(zhǎng)與cDNA一致,無(wú)內(nèi)含子。預(yù)測(cè)為葉綠體FAD2,和大豆FAD2親緣關(guān)系最近,同源性達(dá)85％。
　　 3.組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn):SAD與FAD2在白銀豆根和莖中幾乎不表達(dá),而在葉中表達(dá)量很高；而FAD3在根、莖、葉中均有表達(dá),以葉中表達(dá)量最高。
　　 4.運(yùn)用半定量RT-PCR法分析各基因在

6、生長(zhǎng)臨界低溫以及高溫、鹽和干旱處理下的表達(dá)情況。結(jié)果表明:四種脅迫均能誘導(dǎo)FAD2基因的表達(dá),而高溫和鹽脅迫對(duì)SAD和FAD3基因的表達(dá)有抑制作用。隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng),3個(gè)基因呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式。SAD基因的表達(dá)逐漸下調(diào),到12 h時(shí)表達(dá)量最低,經(jīng)過(guò)隨后的12 h低溫黑暗后其表達(dá)量逐漸回升直到最大。FAD3表達(dá)在低溫處理3 h時(shí)達(dá)最大值,一直保持到低溫處理12 h,但隨后表達(dá)降低。FAD2在低溫處理過(guò)程之初瞬間表達(dá)上調(diào),低溫處理1