毛霉Δ6-脂肪酸脫飽和酶基因啟動子的克隆和功能鑒定.pdf

1、γ-亞麻酸（GLA）是廣泛分布于自然界且對人體具有重要生理作用的一種多不飽和脂肪酸?！?-脂肪酸脫飽和酶是生物體合成GLA的關(guān)鍵限速酶，為進一步研究其基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子機制，通過銜接頭PCR（LA-PCR），從Mucor sp.EIM-10中擴增得到1291 bp△6-脂肪酸脫飽和酶基因5’端側(cè)翼區(qū)域的單一產(chǎn)物，將序列在多個轉(zhuǎn)錄因子、啟動子數(shù)據(jù)庫中進行比對分析并應用多種計算機軟件和多個啟動子在線預測網(wǎng)站等進行分析，發(fā)現(xiàn)其具有真核啟動子序

2、列的基本結(jié)構(gòu)特征，如具有CAAT盒、TATA框、GC盒等眾多元件。
　　 本實驗以構(gòu)建好的穿梭載體PYGFP，PYESMCD6為基礎構(gòu)建啟動子功能檢測載體PYMCD6。將克隆得到的△6-脂肪酸脫飽和酶基因啟動子插入PYMCD6，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒PYMD6PMCD6。進一步發(fā)酵實驗表明，當添加底物亞油酸（LA）后，含有△6-脂肪酸脫飽和酶啟動子區(qū)域的重組酵母脂肪酸甲酯組分中出現(xiàn)GLA新峰，證明所獲得的△6-脂肪酸脫飽和酶基因5’端

3、側(cè)翼區(qū)域能啟動△6-脂肪酸脫飽和酶基因的表達。
　　 真核生物啟動子區(qū)域中具有多種調(diào)控元件，且不同的基因具有不同的上游啟動元件，其位置也不相同，這使得不同的基因表達分別有不同的調(diào)控機理。通過亞克隆技術(shù)得到不同長度的Mucor sp.EIM-10△6-脂肪酸脫飽和酶基因啟動子片段，并將其連入前文已構(gòu)建的啟動子功能檢測載體PYMCD6，轉(zhuǎn)化釀酒酵母尿嘧啶缺陷型菌株。篩選出陽性克隆后進行發(fā)酵試驗并根據(jù)底物轉(zhuǎn)化率分析其不同長度啟動子片段

4、的轉(zhuǎn)錄功能。結(jié)果表明含有不同長度啟動子缺失片段（除了-121 bp）重組表達載體的重組酵母脂肪酸甲酯組分中均能夠出現(xiàn)GLA新峰，底物轉(zhuǎn)化率隨著啟動子長度的減少而逐漸降低。但若缺少了-919 bp～784 bp片段的啟動子底物轉(zhuǎn)化率會出現(xiàn)大幅度下降并且十分不穩(wěn)定。這說明-919 bp～-784 bp區(qū)域極有可能具有增強子作用。
　　 為進一步確定啟動子區(qū)域中-919 bp～-784 bp的增強子作用，利用重疊延伸PCR技術(shù)將Muc

5、or sp.EIM-10△6-脂肪酸脫飽和酶基因啟動子中-919～-784 bp片段和只具有極低轉(zhuǎn)化率的-434～-1 bp片段融合，并將融合片段插入前文已構(gòu)建的啟動子功能檢測載體PYMCD6，構(gòu)建重組表達載體PYOL94MCD6，轉(zhuǎn)化釀酒酵母尿嘧啶缺陷型菌株INVScl后進行發(fā)酵實驗。結(jié)果表明，當添加底物亞油酸（LA）后，含有啟動子區(qū)域中-919～-784 bp和-434～-1 bp融合片段的重組酵母脂肪酸甲酯組分中出現(xiàn)GLA新峰，轉(zhuǎn)