皺紋盤鮑Δ5脂肪酸去飽和酶研究.pdf

1、本論文以皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai Ino）為研究對象，對合成長鏈多不飽和脂肪酸（Long chain polyunsaturated fatty acid，LC-PUFA）的關(guān)鍵酶-Δ5脂肪酸去飽和酶（Δ5 fatty acyl desaturase，F(xiàn)ad）展開相關(guān)研究。研究內(nèi)容包括：Δ5Fad基因克隆、全長序列分析、基因功能驗證和組織表達；同時研究了飼料中不同種類的脂肪酸（C18脂肪酸和 LC-PUFA

2、）以及不同梯度的底物脂肪酸對稚鮑存活、生長、肝胰腺和肌肉組織脂肪酸合成能力以及Δ5Fad基因表達的影響。
　　1、大多數(shù)海水動物 LC-PUFA的合成能力很差，主要是因為缺乏Δ5Fad基因或者Δ5去飽和活性偏低。然而，許多研究表明鮑魚具有一定的以 C18多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid，PUFA）為底物來合成 LC-PUFA的能力。然而，關(guān)于鮑魚 LC-PUFA合成過程相關(guān)酶的研究以及分子調(diào)節(jié)機

3、制還鮮有報道。本研究成功在皺紋盤鮑體內(nèi)克隆到了Δ5Fad并對其進行了鑒定分析。研究結(jié)果表明，皺紋盤鮑體內(nèi)存在兩條Δ5Fad，Hdhfad1（GQ470626）和Hdhfad2（GQ466197）。Hdhfad1 cDNA全長1530bp，開放閱讀框編碼一個由438個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，5'端包括99bp的非編碼區(qū)，3'端包括114bp的非編碼區(qū)。Hdhfad2全長1525bp，開放閱讀框編碼一個由439個氨基酸組成的蛋白，5'端包括91

4、bp的非編碼區(qū)，3'端包括114bp的非編碼區(qū)。Hdhfad1和Hdhfad2 cDNA序列同源性高達96.82％，編碼區(qū)氨基酸同源性高達96.58%。它們都具有 front-end去飽和酶的顯著結(jié)構(gòu)特征，包括三個組氨酸保守區(qū)、細胞色素b5區(qū)的HPGG和跨膜結(jié)構(gòu)。進化樹分析顯示，它們與章魚Fad的進化關(guān)系最近。異源酵母表達分析表明Hdhfad1和Hdhfad2都具有Δ5去飽和功能，對n-3系底物脂肪酸20:4n-3的親和力大于n-6系底

5、物20:3n-6，并且 Hdhfad1的去飽和活性高于Hdhfad2。Hdhfad1和Hdhfad2在鮑魚肝胰腺和腸中表達較高，并且在所有檢測組織中 Hdhfad2的表達量均高于Hdhfad1。綜上所述，鮑魚體存在兩條有功能的Δ5Fad（Hdhfad1和 Hdhfad2），Hdhfad1的去飽和活性高于Hdhfad2，但其組織表達量低于Hdhfad2。本研究為進一步了解鮑魚 LC-PUFA合成能力提供了分子信息，為將來運用營養(yǎng)手段調(diào)節(jié)鮑

6、魚合成 LC-PUFA奠定了分子基礎(chǔ)。
　　2、以體重為0.38±0.01g，殼長為15.06±0.21mm的皺紋盤鮑稚鮑為研究對象，在室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行為期120天的養(yǎng)殖試驗，研究了飼料中的不同脂肪源對鮑魚存活、生長、脂肪酸組成和Δ5Fad（Hdhfad1和Hdhfad2）基因表達的影響。實驗采用6種不同的油脂作為飼料脂肪源配置精制飼料，包括富含16:0的棕櫚酸甘油酯（Tripalmitin，TP）、富含18:1n-9的橄

7、欖油（Olive Oil，OO）、富含18:2n-6葡萄籽油（Grape Seed Oil，GO）、富含18:3n-3的亞麻籽油（Linseed Oil，LO）、富含ARA的ARA油（ARA Oil，AO）以及富含EPA和DHA的EPA油（EPA Oil，EO）。每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)50頭鮑魚。結(jié)果表明：各組飼料對鮑魚的存活率無顯著影響，卻顯著影響了鮑魚的生長。與對照TP處理組相比，OO（富含18:1n-9）、AO（富含ARA）和

8、EO（富含EPA和DHA）飼料顯著提高了鮑魚的增重率（weight gain rate，WGR）、特定生長率（specific growth rate of weight，SGRW）、貝殼增長率（shell length increase rate，SIR）、貝殼日增長率（daily growth rate of shell length，DGRSL）等生長指標（P<0.05）。GO飼料（富含18:2n-6）組鮑魚的WGR、SGRW、S

9、IR和DGRSL與對照組無顯著差異（P>0.05）。LO飼料（富含18:3n-3）處理組鮑魚的生長在所有處理組中最差。與對照組相比，OO飼料顯著提高了鮑魚肝胰腺和肌肉組織20:1n-9和22:1n-9的含量。GO飼料顯著提高了鮑魚n-6 PUFA的含量，尤其是ARA。而LO飼料則顯著提高了鮑魚n-3 PUFA的含量，尤其是EPA。AO和EO飼料則顯著提高了鮑魚體LC-PUFA的含量?；虮磉_分析表明，與對照組（TP）相比，LO飼料中富含

10、的18:3n-3顯著提高鮑魚肝胰腺和肌肉組織Δ5Fads的表達，而飼料中富含的LC-PUFA，比如ARA、EPA和DHA等，顯著降低了Δ5Fads的表達。Δ5Fads不受飼料中富含的18:1n-9和18:2n-6的調(diào)節(jié)。綜上所述，鮑魚具有以C18PUFA為底物合成LC-PUFA的能力，合成關(guān)鍵酶Δ5Fads的表達同時受到底物脂肪酸（18:3n-3）和產(chǎn)物脂肪酸（LC-PUFA）的調(diào)節(jié)。
　　3、以體重為0.38±0.01g，殼長為

11、15.06±0.21mm的皺紋盤鮑稚鮑為研究對象，在室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行為期120天的養(yǎng)殖試驗，研究了飼料中的不同梯度植物油（富含18:2n-6的GO和富含18:3n-3的LO）對鮑魚存活、生長、肝胰腺和肌肉脂肪酸組成以及Δ5Fads（Hdhfad1和Hdhfad2）基因表達的影響。實驗制作7種精致飼料，分別含有0%、0.875%、1.5%和3.5%的GO或者LO為脂肪源。飼料脂肪不足3.5%的，添加TP補足到3.5%。TP飼料處理

12、組鮑魚為對照組。各組飼料分別命名為0%GO/LO（TP）、25%GO、50%GO、100%GO、25%LO、50%LO和100%LO。隨著飼料中GO或者LO含量的不斷增加，鮑魚的生長指標（如特定生長率等）顯著性的先上升后下降（R2>0.72, P=0.000）。各組鮑魚的存活率不受飼料中GO（R2=0.04, P=0.815）或LO含量的顯著影響（R2=0.50, P=0.046）。脂肪酸分析表明，隨著GO飼料中18:2n-6的不斷增加

13、，鮑魚肝胰腺和肌肉組織中18:2n-6、20:2n-6和22:2n-6的含量逐漸增加；肝胰腺中ARA的含量先上升后趨于平穩(wěn)，而肌肉組織中ARA的含量逐漸增加。隨著LO飼料中18:3n-3的不斷增加，鮑魚肝胰腺18:3n-3和20:3n-3的含量不斷增加，EPA的含量先上升后趨于平穩(wěn)，DPA和DHA的含量先上升后下降；肌肉組織中18:3n-3和20:3n-3的含量不斷增加，EPA和DPA的含量先上升后保持平穩(wěn)，DHA的含量則先上升后下降。