豬胚胎多能性干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定.pdf

1、來(lái)源于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的ES細(xì)胞和來(lái)源于PGC的EG細(xì)胞能在體外無(wú)限擴(kuò)增并保持它們的分化潛能.在合適的培養(yǎng)條件下,ES/EG細(xì)胞可以分化成各種細(xì)胞類型,通過(guò)囊胚注射等方法可以形成嵌合體動(dòng)物并參與生殖系細(xì)胞的形成.因此,ES/EG細(xì)胞在細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、基因調(diào)節(jié)、家畜改良、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)以及移植治療等方面具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值.該論文研究了不同飼養(yǎng)層類型對(duì)分離培養(yǎng)豬胚胎干細(xì)胞的影響,并探討了用體內(nèi)囊胚、體外生產(chǎn)胚胎和早期豬胎兒的PGC分

2、離培養(yǎng)豬胚胎多能性干細(xì)胞的方法和可能性.分別采用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)、豬胚胎成纖維細(xì)胞(PEF)和STO細(xì)胞制作飼養(yǎng)層來(lái)培養(yǎng)豬囊胚及其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM),經(jīng)2-5d培養(yǎng)后,囊胚在三種飼養(yǎng)層上形成原代類ES細(xì)胞集落的形成率差別不明顯;ICM在三種飼養(yǎng)層上形成原代類ES細(xì)胞集落的形成率分別為:75％,65％和20％,最高傳代數(shù)分別是9代,5代和1代.用免疫熒光法對(duì)三種飼養(yǎng)層細(xì)胞的微管進(jìn)行染色,結(jié)果顯示STO細(xì)胞的熒光分布遠(yuǎn)低于MEF

3、和PEF,證明前者的微管數(shù)量遠(yuǎn)低于后兩者,提示該實(shí)驗(yàn)室使用的STO細(xì)胞可能已經(jīng)衰老,已不適合用于制作飼養(yǎng)層來(lái)培養(yǎng)ICM和ES細(xì)胞,這與上述培養(yǎng)結(jié)果相符.這些結(jié)果說(shuō)明MEF是相對(duì)較好的飼養(yǎng)層細(xì)胞,同時(shí)也提示了飼養(yǎng)層細(xì)胞微管數(shù)量的多少與原代類ES細(xì)胞集落的產(chǎn)生與穿代存在一定的正相關(guān).因此,微管數(shù)量可以作為推測(cè)飼養(yǎng)層細(xì)胞質(zhì)量的指標(biāo)之一.以中國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬為實(shí)驗(yàn)材料,收集7-9d的豬囊胚,部分囊胚用酶消化法分離ICM,剩余囊胚(20)和分離到的

4、ICM(28)分別接種到MEF飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng).研究發(fā)現(xiàn)酶消化法分離ICM不會(huì)對(duì)ICM細(xì)胞造成損傷,所有的ICM都能貼附于飼養(yǎng)層上,其中68％的ICM能形成原代類ES細(xì)胞集落,高于全胚培養(yǎng)產(chǎn)生原代類ES細(xì)胞集落的形成率(28％),并得到兩株傳6—9代的類ES細(xì)胞.這些類ES細(xì)胞集落形態(tài)上類似于小鼠ES細(xì)胞克隆:集落邊界明顯,形似島丘或鳥(niǎo)巢狀,細(xì)胞之間界限不清,胞體較小,核較大,表達(dá)AP活性.當(dāng)把這些類ES細(xì)胞培養(yǎng)在沒(méi)有飼養(yǎng)層和LIF的培

5、養(yǎng)基中或延時(shí)培養(yǎng)時(shí),能分化形成不同的細(xì)胞類型,包括上皮樣細(xì)胞、神經(jīng)樣細(xì)胞和平滑肌樣細(xì)胞;而懸浮培養(yǎng)時(shí)能形成類胚體.這些結(jié)果提示ICM培養(yǎng)法優(yōu)于全胚培養(yǎng)法,該實(shí)驗(yàn)得到的類ES細(xì)胞具有多能性,豬的ES細(xì)胞系是可以在該實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件下建立的.在實(shí)驗(yàn)中我們還探索了一種新的分離豬囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的方法—酶消化手術(shù)法,首次發(fā)現(xiàn)了呈"凹"形擴(kuò)展的非集落式生長(zhǎng)的類ES細(xì)胞,提示胚胎干細(xì)胞可能存在多種生長(zhǎng)方式,而不總是單一的克隆式生長(zhǎng)方式.利用體外生產(chǎn)的胚胎分

6、離培養(yǎng)多能性干細(xì)胞具有更為重要的研究和應(yīng)用價(jià)值.該實(shí)驗(yàn)采用豬卵母細(xì)胞的體外成熟和體外受精技術(shù)來(lái)生產(chǎn)豬胚胎,收集不同時(shí)期的胚胎培養(yǎng)在含有干細(xì)胞培養(yǎng)液和MEF飼養(yǎng)層的培養(yǎng)孔中,只有囊胚期的胚胎產(chǎn)生類ES細(xì)胞集落.這些集落傳代后有新的集落產(chǎn)生,但傳到第4代時(shí)沒(méi)有觀察到有新的類ES集落生成.這些集落具有ES細(xì)胞形態(tài),能表達(dá)AP活性,細(xì)胞培養(yǎng)在沒(méi)有飼養(yǎng)層和不含LIF的培養(yǎng)基中會(huì)分化成多種細(xì)胞類型,懸浮培養(yǎng)能形成類胚體.這些結(jié)果提示用體外生產(chǎn)的豬胚

7、胎可以培養(yǎng)到類ES細(xì)胞,這些細(xì)胞具有多能性.作為培養(yǎng)多能性干細(xì)胞的重要細(xì)胞來(lái)源之一原始生殖細(xì)胞(PGC)一直是人們關(guān)注和研究的焦點(diǎn)之一.該實(shí)驗(yàn)收集25-30日齡的豬胎兒,先通過(guò)AP染色法快速定位PGC,再以機(jī)械法從生殖嵴部位分離出PGC,經(jīng)消化離散后培養(yǎng)在鋪有MEF飼養(yǎng)層和含有干細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)孔中.經(jīng)2-4天培養(yǎng)后出現(xiàn)大量原代類EG細(xì)胞集落,并表達(dá)AP活性,但大多類EG細(xì)胞集落傳3-4代后分化消失.以上結(jié)果提示以MEF制作飼養(yǎng)層,以中