山羊和大鼠胎兒神經(jīng)干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定.pdf

1、該研究以山羊和Wistar大鼠胎兒為材料,建立胎兒大腦皮層和脊髓組織顯微解剖分離技術(shù)和NSCs無血清培養(yǎng)技術(shù);另外,以SD大鼠胎兒為材料,進行了神經(jīng)干細胞的冷凍解凍實驗.對NSCs的分離方法、影響NSCs分離與增殖的因素和其特性進行了探討,為進一步建立NSCs細胞系和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).實驗主要結(jié)果如下:1.利用顯微解剖技術(shù)從6只胎齡為24~35 d(體尺為1.6~3.9 cm)的山羊胎兒中分離得到大腦皮層組織,制成單細胞懸液,用D-M

2、EM/F12+10%NBS+10ng/mL EGF+10ng/mL bFGF+100IU/mL青霉素+100IU/mL鏈霉素作為培養(yǎng)液,4只得到原代GFPNSCs神經(jīng)球樣集落,應(yīng)用機械法最高傳至第3代.2.利用顯微解剖技術(shù)從12只懷孕Wistar大鼠得到128只胎齡為12~19d的胎兒分離得到脊髓組織,制成單細胞懸液,用D-MEM/F12+B27+20ng/mL EGF+20ng/mL bFGF+10ng/mL LIF+10ng/mL

3、ITS+100IU/mL青霉素+100IU/mL鏈霉素作為培養(yǎng)液,有9只Wister孕鼠得到RFSCNSCs,機械法結(jié)合0.125%胰蛋白酶消化法傳代,最高傳至6代.3.利用顯微解剖技術(shù)從6只懷孕SD只大鼠得到69只胎齡為12~17d的胎兒分離得到脊髓組織,制成單細胞懸液,用D-MEM/F12+B27+20ng/mL EGF+20ng/mL bFGF+10ng/mL LIF+10ng/mL ITS+100 IU/mL青霉素+100IU/

4、mL鏈霉素作為培養(yǎng)液,將處于對數(shù)生長期的RFSCNSCs機械法結(jié)合0.125%胰蛋白酶消化法制成單細胞懸液,以D-MEM/F12+20%NBS+10%DMSO作為冷凍保護液冷凍保存,解凍后進行培養(yǎng)、并鑒定其仍具有神經(jīng)干細胞特性.4.所獲得的GFPNSCs和RFSCNSCs經(jīng)過形態(tài)學(xué)、單克隆實驗、誘導(dǎo)分化實驗和免疫組化染色分析,其結(jié)果證明具有NSCs諸多生物學(xué)特性.該次實驗首次證明了山羊胎兒大腦中同樣存在神經(jīng)干細胞,并且成功地獲得了RFS