7，12-二甲基苯蒽（DMBA）體外誘導(dǎo)山羊乳腺上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化.pdf

1、　　本試驗(yàn)對(duì)山羊乳腺組織細(xì)胞的分離及原代培養(yǎng)方法進(jìn)行了改進(jìn)，并對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的一些生長(zhǎng)特性作了總結(jié)；在此基礎(chǔ)上，以7,12-二甲基苯蒽(DMBA)為致癌劑，佛波酯(TPA)為促癌劑，探索了乳腺上皮細(xì)胞體外兩步法轉(zhuǎn)化的過程，摸索了改良Feulgen染色的程序，為進(jìn)一步利用ICM(顯微圖像分析儀)對(duì)轉(zhuǎn)化過程中核DNA含量的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)奠定基礎(chǔ)，結(jié)果如下：1.用組織塊培養(yǎng)法和消化法均可獲得良好的山羊乳腺細(xì)胞原代培養(yǎng)物；培養(yǎng)的山羊乳腺成纖維

2、細(xì)胞比上皮細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶更敏感，混合培養(yǎng)物用0.15﹪胰蛋白酶與0.02﹪EDTA消化液在37℃控時(shí)消化，先脫落下來的主要為成纖維細(xì)胞，經(jīng)過2～3代傳代篩選培養(yǎng)，即可得到純化的乳腺上皮細(xì)胞。2.用添加10﹪DMSO和10﹪胎牛血清的DMEM/F12為凍存液，按直徑不同將山羊乳腺組織塊分成3組：小于0.3mm，0.3～0.5mm和0.5～1.0mm，并適當(dāng)延長(zhǎng)體外平衡時(shí)間進(jìn)行冷凍保存。結(jié)果表明：以直徑＜0.3mm，每管不超過6塊為佳，采用

3、室溫平衡6h后分兩次梯度添加DMSO至10﹪，于0℃平衡1h，-20℃平衡2h，直接投入到液氮中的凍存效果較好。3.用DMEM/F12體外培養(yǎng)山羊乳腺上皮細(xì)胞，傳至第9代時(shí)其生長(zhǎng)仍正常。多數(shù)上皮細(xì)胞呈短梭形或多角形，呈蜂窩狀；部分細(xì)胞呈圓餅狀，體積較大。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)細(xì)胞上清液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，其中有3個(gè)條帶與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的3個(gè)條帶一致，表明山羊乳腺上皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下能表達(dá)山羊酪蛋白。4.以含5ug/mL、10ug

4、/mL、15ug/mLDMBA的完全培養(yǎng)液對(duì)組織塊和消化法得到的細(xì)胞分別進(jìn)行36h，24h和12h處理后，施以25ng/mLTPA作用2周，結(jié)果顯示，15ug/mLDMBA作用12h組細(xì)胞基本死亡，5ug/mLDMBA36h組細(xì)胞轉(zhuǎn)化效果最佳；轉(zhuǎn)化細(xì)胞的初期形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為：細(xì)胞增大，扁平；隨后細(xì)胞核濃縮，細(xì)胞整體變?。唤又?xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)無規(guī)則生長(zhǎng)；最后出現(xiàn)轉(zhuǎn)化灶。5.應(yīng)用改良Feulgen染色法定量監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞核DNA的變化，以