轉(zhuǎn)Temporin-GFP融合基因的山羊乳腺上皮細(xì)胞株的篩選.pdf

1、抗菌肽(antimicrobial peptides,ABP)作為一種廣泛存在于生物界僅需20-60個(gè)氨基酸組成的小分子活性肽，在抗細(xì)菌和真菌以及病原蟲(chóng)、病毒或腫瘤細(xì)胞方面都有明顯的作用。為了建立大量獲取抗菌肽(antimicrobial peptides,ABP)的簡(jiǎn)便有效方法，本研究采用分子生物學(xué)等方法，構(gòu)建了可以表達(dá)抗菌肽Temporin與GFP融合蛋白的乳腺特異性表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染到奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中后，通過(guò)G418藥物篩選

2、出含有neo抗性基因的轉(zhuǎn)Tem-GFP基因陽(yáng)性細(xì)胞，并篩選獲得基因組中整合有中國(guó)林蛙抗菌肽基因的奶山羊乳腺上皮細(xì)胞。本研究進(jìn)一步利用該細(xì)胞株通過(guò)體細(xì)胞核移植的方法獲得乳腺特異表達(dá)抗菌肽的轉(zhuǎn)基因山羊的相關(guān)研究提供了科學(xué)依據(jù)。
　　研究結(jié)果與結(jié)論如下:
　　1、中國(guó)林蛙皮膚抗菌肽基因的克隆:根據(jù)GenBank中的中國(guó)林蛙皮膚抗菌肽基因mRNA序列(EU624139)設(shè)計(jì)引物CEa1和2CEa，以提取的中國(guó)林蛙皮膚總RNA為模板，

3、進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增出中國(guó)林蛙皮膚抗菌肽的cDNA。將Temporin的PCR產(chǎn)物與pEASY-T3載體連接，構(gòu)建出T3-Tem-2CEa克隆載體。
　　2、乳腺特異表達(dá)載體的構(gòu)建:以T3-Tem-2CEa為模板利用引物CEa3引入Xba1酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增后連入pEASY-T3載體中構(gòu)建T3-Tem-CEa3。再利用酶切、連接等分子克隆手段，將GFP片段插入T3-Tem-CEa3載體后，構(gòu)建T3-Tem-GFP載體。利用Xho

4、Ⅰ與SalⅠ將Tem-GFP片段切下，與XhoⅠ線性化的pBC-1相連接，連接方向鑒定正確后，即成功構(gòu)建出含有抗菌肽以及GFP融合基因的pBC-1乳腺特異表達(dá)載體。
　　3、轉(zhuǎn)抗菌肽融合蛋白基因的山羊乳腺上皮細(xì)胞的篩選與培養(yǎng):采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染線性化的重組乳腺特異性表達(dá)載體到奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中，利用G418篩選獲得具有neo抗性基因的陽(yáng)性細(xì)胞。
　　4、對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞的鑒定:將獲得的陽(yáng)性細(xì)胞富集后提取細(xì)胞基因組，PCR結(jié)果