人乳鐵蛋白基因乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及在山羊乳腺上皮細(xì)胞系中的表達(dá).pdf

1、人乳鐵蛋白(hLTF)，也稱人乳轉(zhuǎn)鐵蛋白，是乳汁中主要的鐵結(jié)合蛋白，廣泛分布于多種組織、細(xì)胞內(nèi)，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和機(jī)體內(nèi)鐵的平衡、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)等方面具有重要作用。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)重組人乳鐵蛋白(rhLTF)的研究對(duì)人類健康有很重要的現(xiàn)實(shí)意義，具有廣闊的市場(chǎng)前景和重要的理論價(jià)值。 轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物是指將轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)與克隆動(dòng)物技術(shù)相結(jié)合，以動(dòng)物體細(xì)胞(包括動(dòng)物成體體細(xì)胞、胎兒成纖維細(xì)胞等)為受體，將目的基因以DNA轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入能進(jìn)行

2、傳代培養(yǎng)的動(dòng)物體細(xì)胞，再以這些體細(xì)胞為核供體，進(jìn)行動(dòng)物的克隆。 本買驗(yàn)以此理論為基礎(chǔ)，從乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建、奶山羊乳腺上皮細(xì)胞(GMECs)系的建立、外源基因轉(zhuǎn)染奶山羊乳腺上皮細(xì)胞、轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立等幾個(gè)方面進(jìn)行研究，建立了乳腺特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞系，為下一步的轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物的制備奠定了基礎(chǔ)。1人乳鐵蛋白基因乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建 本買驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)室已有的人乳鐵蛋白cDNA(2320bp)、牛a-S1

3、酪蛋白(asl-casein)5’端(6.3Kb)和3’端(1.5Kb)表達(dá)調(diào)控序列、Neo(700bp)、增強(qiáng)子、P01vA序列，構(gòu)建了人乳鐵蛋白乳腺特異性表達(dá)載體afLF。人乳鐵蛋白cDNA為從正常婦女乳腺細(xì)胞cDNA厙中，利用高保真Taq酶PCR法擴(kuò)增出，含信號(hào)肽序列和3，終止信號(hào)。牛a-S1酪蛋白系用PCR方法從牛基因組DNA中擴(kuò)增出5’調(diào)控區(qū)(2.3Kb)和3’調(diào)控區(qū)(1.5Kb)，然后在5’端上游增加長(zhǎng)約為4Kb牛酪蛋白基因

4、的基因組DNA調(diào)控序列。增強(qiáng)子為本實(shí)驗(yàn)室以相應(yīng)的質(zhì)粒DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得，含有ATG和Kozak保守序列。Neo基因來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室保存質(zhì)粒。2外源基因片段轉(zhuǎn)染奶山羊乳腺上皮細(xì)胞及陽(yáng)性細(xì)胞株的建立 山羊乳腺上皮細(xì)胞，采用乳腺組織塊膠原酶消化法，DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，獲得混雜的原代乳腺細(xì)胞，通過(guò)胰蛋白酶分步消化，經(jīng)2-3代純化，獲得較純化的山 羊乳腺上皮細(xì)胞。 通過(guò)電轉(zhuǎn)染法將含有抗性基因Neo<

5、'r>的afLF基因片段導(dǎo)入到體外培養(yǎng)4.5代的山羊乳腺上皮細(xì)胞(GMECs)，經(jīng)含400μg／ml G418的篩選培養(yǎng)液篩選三周后，得到有抗性的細(xì)胞株26株，克隆環(huán)挑取單克隆株并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。提取上述細(xì)胞DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，有14株細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染了外源基因。對(duì)轉(zhuǎn)染有外源基因的細(xì)胞株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)ELISA檢測(cè)，共有2株細(xì)胞能穩(wěn)定表達(dá)人乳鐵蛋白。 結(jié)果表明，我們所構(gòu)建的乳腺特異性表達(dá)載體轉(zhuǎn)染GMECs，能夠表達(dá)相應(yīng)的重