亞硝酸鈉聯(lián)合抗真菌藥物對紅色毛癬菌體外抗菌實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:紅色毛癬菌(trichophyton rubrum)是一種最常見的親人性致病性皮膚癬菌,主要侵犯人的皮膚,指(趾)甲,偶可侵犯人的毛發(fā)。國內(nèi)外多個(gè)研究均顯示在淺部真菌病患者病原菌分析中,紅色毛癬菌的分離率占到首位。此外,國內(nèi)金學(xué)洙等人吉林15年菌種分析研究顯示在頭癬致病菌中,紅色毛癬菌的分離率隨年代逐漸增高,到90年代后期,由80年代后期的10.6％明顯增高至76.9％。紅色毛癬菌不僅引起皮膚感染,最近報(bào)道也引起深部組織感染如膿癬

2、、肉芽腫等,其發(fā)病率也在逐年升高。由于該菌所致真菌病病程持久,且難治愈,易復(fù)發(fā),成為臨床亟待研究問題之一。
　　 臨床上對于紅色毛癬菌引起的足癬治療,推薦采用“1+1聯(lián)合治療”方案,即一種外用抗真菌藥物加一種口服抗真菌藥物聯(lián)合治療,可以縮短療程、提高療效及患者依從性、降低復(fù)發(fā)率。目前臨床上應(yīng)用的抗真菌藥物對紅色毛癬菌病有較好的療效,但這些藥物大都價(jià)格昂貴,毒副作用較大,且隨著這些抗真菌藥物的廣泛應(yīng)用,耐藥菌株不斷出現(xiàn),為臨床治療

3、帶來困難。為減少藥物不良反應(yīng),減少耐藥菌株出現(xiàn),臨床常采用聯(lián)合用藥。亞硝酸鈉是一種常用的食品添加劑,世界食品衛(wèi)生科學(xué)委員會(huì)1992年發(fā)布的人體安全攝入亞硝酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)為0～0.1mg/kg體重,按此標(biāo)準(zhǔn)使用和食用,對人體不會(huì)造成危害。亞硝酸鈉來源豐富,成本低廉,國外已有研究證實(shí)亞硝酸鈉在酸性條件下對多種酵母菌及皮膚癬菌有較強(qiáng)的殺傷作用,并且臨床上應(yīng)用其外用制劑治療足癬及甲真菌病有效。我科研究人員既往曾應(yīng)用MTT法測定亞硝酸鈉對紅色毛癬菌抗

4、菌活性的影響,結(jié)果顯示在沙氏液基中亞硝酸鈉對紅色毛癬菌具有抑制作用;在1.25mmol/L～160mmol/L濃度范圍內(nèi),亞硝酸鈉純品對紅色毛癬菌無細(xì)胞毒作用,其中在1.25mmol/L～10mmol/L濃度范圍內(nèi),隨著作用濃度的增加,抑制作用逐漸增強(qiáng);而在10mmol/L～160mmol/L濃度范圍內(nèi)對紅色毛癬菌抑制作用差異無顯著性。電鏡觀察結(jié)果顯示,亞硝酸鈉影響菌絲超微結(jié)構(gòu),表現(xiàn)為菌絲的形態(tài)學(xué)改變以及紅色毛癬菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的破壞,

5、并在一定濃度范圍內(nèi)隨亞硝酸鈉藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長,對菌絲破壞程度增強(qiáng),呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性。但目前尚未見亞硝酸鈉聯(lián)合其他臨床常用抗真菌藥物對紅色毛癬菌體外聯(lián)合抗菌作用的報(bào)道。
　　 在過去的幾年里,對于皮膚癬菌的體外藥敏試驗(yàn)方法及結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)尚無統(tǒng)一界定,直至2008年,美國國家臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)提出了產(chǎn)孢絲狀真菌微量液基稀釋法抗真菌藥敏試驗(yàn)方案(M38-A方案)的第二次改良方案(M38-A2方案),

6、其中增加了皮膚癬菌的相關(guān)內(nèi)容。本試驗(yàn)參照該方案及其他相關(guān)文獻(xiàn),采用微量稀釋法應(yīng)用亞硝酸鈉聯(lián)合伊曲康唑、特比萘芬、氟康唑、伏立康唑及卡泊芬凈五種抗真菌藥物對臨床分離的30株紅色毛癬菌進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn),以探討其體外聯(lián)合用藥的抗菌活性及最佳聯(lián)合濃度,從而指導(dǎo)臨床合理使用抗真菌藥,有效預(yù)防和治療紅色毛癬菌引起的真菌感染性疾病提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 1菌株分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 30株紅色毛癬菌均分離自河北醫(yī)科大學(xué)

7、第二醫(yī)院皮膚科門診的股癬及甲真菌病患者。自病變部位取材鏡檢并培養(yǎng),根據(jù)顯微鏡下特征及沙氏和馬鈴薯培養(yǎng)基菌落特征等鑒定為紅色毛癬菌。
　　 2體外藥敏試驗(yàn)
　　 2.1抗真菌藥物單獨(dú)藥敏試驗(yàn)
　　 用移液器分別取抗真菌藥物倍比稀釋液100uL,依次加入96孔板的每行第1～10孔中,第11、12孔為空白及陽性對照,分別加入200uL及100uL RPMI1640液體培養(yǎng)基。將菌懸液用RPMI1640液體培養(yǎng)基稀釋50

8、倍,得到二倍終濃度菌懸液,再依次將100uL,菌懸液加入96孔板的第1～10列及第12列。30℃恒溫培養(yǎng)4～7天,陽性對照100％生長后判讀結(jié)果。
　　 2.2亞硝酸鈉交叉聯(lián)合抗真菌藥物藥敏試驗(yàn)
　　 用微量移液器將藥物加入96孔板內(nèi),其中每行的第1～10孔,依次加入亞硝酸鈉倍比稀釋液50uL,濃度從高到低;每列第1～8孔依次加入抗真菌藥物倍比稀釋液50uL,濃度從高到低,余操作同單獨(dú)藥敏試驗(yàn)。30℃恒溫培養(yǎng)5～7天,陽

9、性對照100％生長后判讀結(jié)果。
　　 3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:
　　 應(yīng)用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。單獨(dú)應(yīng)用抗真菌藥物MIC值之間比較采用多獨(dú)立樣本比較的Kruskal-wallis H檢驗(yàn),進(jìn)一步兩兩比較采用秩轉(zhuǎn)換后單因素方差分析;各抗真菌藥物聯(lián)合亞硝酸鈉前后MIC值的比較采用配對樣本比較的Wilcoxon符號秩檢驗(yàn);亞硝酸鈉和抗真菌藥物聯(lián)合抗菌FIC值之間以及各抗真菌藥物不同濃度之間FIC值比較采用多個(gè)獨(dú)立樣本

10、比較的Kruskal-wallis H檢驗(yàn),進(jìn)一步兩兩比較采用Nemenyi法檢驗(yàn),P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 本試驗(yàn)參照美國國家臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)提出的(M38-A2)方案,采用微量稀釋法進(jìn)行亞硝酸鈉、伊曲康唑、特比萘芬、氟康唑、伏立康唑及卡泊芬凈單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對臨床分離的30株紅色毛癬菌進(jìn)行體外抗菌活性研究,得出以下結(jié)論:
　　 1亞硝酸鈉在1640液體培養(yǎng)基中對臨床分離