亞硝酸鈉對紅色毛癬菌抑制作用的實驗研究.pdf

1、目的：淺部真菌感染是皮膚科的常見病及多發(fā)病，其中紅色毛癬菌（Trichophyton rubrum）是最常見的一種皮膚癬菌，也是淺部真菌病的主要病原菌之一。紅色毛癬菌屬于親人性皮膚癬菌，主要侵犯人的皮膚、指甲（趾甲），偶可侵犯人的毛發(fā)。有研究統(tǒng)計90％的皮膚癬菌慢性感染是由該菌所致。最近報道紅色毛癬菌不僅引起皮膚感染，也引起深部組織感染，發(fā)病率也在逐年升高。該菌所引起的真菌疾病較難治愈而且容易復(fù)發(fā)和再感染，從而導(dǎo)致患者生活質(zhì)量的下降。<

2、br>　　 紅色毛癬菌感染的淺部真菌病患者首選外用抗真菌藥物，相對安全、便宜、方便，但由于患者依從性等問題，單用一種藥物治療往往耗時長，而且容易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。聯(lián)合用藥可以提高療效，縮短治療時間，提高治愈率。大量研究表明，NO作為活化巨噬細胞產(chǎn)生的一種細胞毒效應(yīng)分子，能介導(dǎo)巨噬細胞抑制和殺傷病毒、細菌、真菌及寄生蟲等病原體，是機體抗感染防御體系中的一個重要因子。既往研究證實真菌感染與機體免疫狀態(tài)密切相關(guān)，而NO能直接影響機體的特異性免疫

3、及非特異性免疫。許多研究者在體外試驗和動物模型中發(fā)現(xiàn)NO在免疫系統(tǒng)中起作用，佟盼琢等研究了30例足癬和35例甲真菌病患者血清中NO和iNOS水平并與正常人群組比較，發(fā)現(xiàn)病例組均低于正常對照組水平且NO和iNOS水平呈直線正相關(guān)關(guān)系。足癬和甲真菌病患者血清NO和iNOS水平降低，也進一步證實了NO在真菌免疫中發(fā)揮一定作用。亞硝酸鈉是一種化學物質(zhì)，在酸中易得電子形成NO。近年來國外研究小組對亞硝酸鈉的殺菌作用進行了體外實驗研究，當pH為4.

4、4時，5～10 mmol/L的亞硝酸化合物可以抑制95％以上的酵母菌生長，在同樣的條件下也觀察到酸性的亞硝酸化合物可以殺滅其它真菌和細菌。同時國外研究也證實了在酸性環(huán)境中亞硝酸鹽對酵母菌，皮膚癬菌均具有較強的殺傷作用。臨床研究局部應(yīng)用酸性的亞硝酸鹽制劑治療由紅色毛癬菌感染引起的甲真菌病患者16周后，大于90％患者的培養(yǎng)結(jié)果轉(zhuǎn)為陰性；應(yīng)用3％亞硝酸物乳膏治療足癬4周，堅持完成整個療程的19位患者中，18人完全治愈。這些體內(nèi)外研究證實酸性的

5、亞硝酸化合物是有效的抗真菌劑，但目前尚未見亞硝酸鈉對紅色毛癬菌抑菌情況和超微結(jié)構(gòu)影響的報道。
　　 MTT是一種測定細胞抑制率的方法，能以數(shù)值形式反映出藥物對細胞的抑制情況。近年來應(yīng)用于念珠菌，曲霉菌等的真菌藥敏試驗，證實是一種快速簡便精確的抗真菌藥敏實驗終點判斷方法。本研究中紅色毛癬菌在含有不同濃度亞硝酸鈉的沙氏液體藥基培養(yǎng)96小時，通過MTT測定亞硝酸鈉對紅色毛癬菌的抑制作用。同時通過掃描電鏡、透射電鏡觀察不同濃度和不同時間

6、亞硝酸鈉對紅色毛癬菌超微結(jié)構(gòu)的影響，為臨床應(yīng)用亞硝酸鈉提供實驗室依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 1菌株選擇：
　　 菌株為河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院真菌室保存的典型紅色毛癬菌，分離自體癬、股癬、足癬、甲真菌病等淺部真菌病患者。根據(jù)顯微鏡下特征、沙氏和馬鈴薯培養(yǎng)基菌落特征等鑒定菌種，選擇紅色毛癬菌30株。
　　 2 MTT法測定不同濃度亞硝酸鈉對紅色毛癬菌的抑制作用：應(yīng)用MTT法測定不同濃度亞硝酸鈉在530nm

7、的吸光度值以此量化對紅色毛癬菌的抑制作用。
　　 3亞硝酸鈉對紅色毛癬菌超微結(jié)構(gòu)的影響：
　　 3.1掃描電鏡：觀察不同濃度亞硝酸鈉（160mmol/L、80mmol/L、40mmol/L、20mmol/L）作用于紅色毛癬菌96小時，160mmol/L亞硝酸鈉作用不同時間（48h、72h和96h）對紅色毛癬菌超微結(jié)構(gòu)的影響，同時設(shè)未加藥物的生長對照組。
　　 3.2透射電鏡：觀察80mmol/L亞硝酸鈉作用96小

8、時對紅色毛癬菌超微結(jié)構(gòu)的影響，同時設(shè)未加藥物的生長對照組。
　　 4統(tǒng)計學方法：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。首先應(yīng)用SPSS13.0軟件計算不同濃度亞硝酸鈉的抑制率，單因素方差分析比較不同濃度的抑制率，進一步兩兩分析采用LSD檢驗，P<0.05為差異有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1 MTT法測定亞硝酸鈉作用96h對紅色毛癬菌抑菌結(jié)果：亞硝酸鈉的濃度為160mmol/L、80mmol/L、40mmo

9、l/L、20mmol/L、10mmol/L、5mmol/L、2.5mmol/L、1.25mmol/L.作用96小時對紅色毛癬菌抑制率依次為：（73.62±9.7％）、（71.93±1.47％）、（73.53±1.14％）、（70.80±1.50％）、（68.67±1.27％）、（41.76±1.53％）、（29.59±1.90％）、（16.98±1.82％）。隨亞硝酸鈉濃度減小，對紅色毛癬菌的抑制率逐漸降低；經(jīng)單因素方差分析P<0.05

10、，差異有統(tǒng)計學意義。進一步兩兩比較結(jié)果：160mmol/L、80mmol/L、40mmol/L、20mmol/L、10mmol/L亞硝酸鈉對紅色毛癬菌抑制率經(jīng)兩兩比較LSD檢驗P>0.05，均無顯著性差異；其余濃度間兩兩比較均P<0.05，差異有顯著性。
　　 2掃描電鏡結(jié)果：
　　 2.1不同濃度亞硝酸鈉作用96h對紅色毛癬菌超微結(jié)構(gòu)影響：未加亞硝酸鈉的正常對照：菌絲生長良好，表面光滑飽滿，粗細均勻；20 mmol/L

11、和40 mmol/L亞硝酸鈉作用96小時：菌絲無明顯變化，形態(tài)正常，表面光滑；80 mmol/L亞硝酸鈉作用96小時：菌絲表面出現(xiàn)小凹陷，菌絲粗細不一，表面不光滑；160 mmol/L亞硝酸鈉作用96小時：菌絲變形膨脹，粗細不一，縮窄處菌絲干癟，出現(xiàn)破壞和斷裂；在80 mmol/L～160 mmol/L范圍內(nèi)隨著亞硝酸鈉濃度的增加，對菌絲形態(tài)改變的影響越明顯。
　　 2.2160 mmol/L亞硝酸鈉作用不同時間對紅色毛癬菌超微

12、結(jié)構(gòu)影響：
　　 160 mmol/L亞硝酸鈉作用48小時：菌絲變化不明顯，粗細較均勻，表面不光滑；160 mmol/L亞硝酸鈉作用72小時：菌絲粗細不均勻，表面欠光滑，出現(xiàn)縮窄斷裂處；160 mmol/L亞硝酸鈉作用96小時：菌絲變形膨脹，粗細不一，縮窄處菌絲干癟，出現(xiàn)破壞和斷裂；隨著亞硝酸鈉作用時間的延長，對菌絲形態(tài)的影響逐漸明顯。
　　 3透射電鏡結(jié)果：
　　 未加亞硝酸鈉的正常對照：菌絲切面較完整，厚薄均

13、勻，胞質(zhì)內(nèi)可見細胞核、線粒體和液泡結(jié)構(gòu)；80 mmol/L亞硝酸鈉作用96小時：細胞腫脹變形，在細胞內(nèi)可見空泡狀結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)形成高電子密度凝集塊。
　　 結(jié)論：
　　 1、亞硝酸鈉對紅色毛癬菌具有抑制作用，亞硝酸納濃度<10mmol/L隨著作用濃度和作用時間的增加，抑制作用逐漸增強；亞硝酸鈉濃度≥10mmol/L對紅色毛癬菌的抑制作用無顯著改變。
　　 2、低濃度和短時間亞硝酸鈉作用對紅色毛癬菌超微結(jié)構(gòu)無影響。高濃