壓力對肝星狀細胞生物活性的影響.pdf

1、研究背景與目的： 門脈高壓癥常見于肝硬化，是以門靜脈系統(tǒng)血液動力學(xué)異常變化為主要特征的綜合征，臨床常并發(fā)致死性上消化道大出血。肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展到肝硬化必經(jīng)的病理改變。肝星狀細胞(hepaticstellatecell，HSC)是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵細胞。目前研究認為靜息型HSC激活轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨虷SC，是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。因此，對肝星狀細胞增殖、活化機制的研究頗受關(guān)注。但國內(nèi)外從生物力學(xué)角度研究HSC增殖活化機

2、制的報道很少。 HSC位于肝板與肝竇內(nèi)皮細胞之間的Disse間隙內(nèi)。Disse間隙通過肝竇內(nèi)皮細胞“窗口”與肝竇相聯(lián)系。在肝纖維化發(fā)展過程中，肝竇及Disse間隙壓力升高，HSC所受壓力增高。胞外壓力環(huán)境的變化有可能調(diào)節(jié)HSC的增殖活化及遷移功能。為此，本論文研究目的旨在揭示壓力在HSC生物活性中的調(diào)節(jié)作用，以深入闡明肝纖維化發(fā)病機制中壓力的重要性，也為肝纖維化的早期干預(yù)提供新的思路。 本研究在體外應(yīng)用壓力加載模型，模擬

3、門脈高壓癥發(fā)展過程中不同大小的壓力，加載壓力作用HSC，觀察壓力對HSC的增殖、活化與遷移功能的影響，并探討其可能機制。研究共分三個部分：(1)大鼠肝星狀細胞的分離鑒定與培養(yǎng)；(2)壓力對HSC增殖活化與遷移的影響；(3)壓力促HSC增殖活化與遷移的機制研究。 方法： 一、HSC的分離培養(yǎng)與鑒定 雄性Sprague-Darwley大鼠(400g-600g)，分離門靜脈并插管，依次灌注鏈酶蛋白酶-膠原酶，37℃原位

4、消化，12％Nycodenz密度梯度離心獲得HSC，含10％胎牛血清(FBS)的DMEM中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液。 臺盼藍染色鑒定細胞存活率。328nm紫外光下觀察HSC自發(fā)免疫熒光，免疫熒光檢測細胞Desmin與α-SMA表達，鑒定HSC純度。 二、壓力對HSC增殖活化與遷移功能的影響 ㈠壓力加載方法 采用可重復(fù)密閉的鋼制圓柱形容器，細胞培養(yǎng)板置于容器內(nèi)，培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)先培養(yǎng)30min；由入口輸入高壓氦氣，出

5、口通過導(dǎo)管連接血壓計以確定加載壓力大小。壓力加載完畢后，關(guān)閉出入口，密閉容器，置于培養(yǎng)箱內(nèi)保持37℃。 ㈡HSC增殖活化的檢測 在6cm培養(yǎng)皿內(nèi)按1×106cells/ml密度種植靜息與活化HSC，無血清DMEM同步化24小時，不同壓力(0mmHg，5mmHg，10mmHg，20mmHg，40mmHg，80mmHg)加載預(yù)設(shè)時間(1h，12h，24h)，培養(yǎng)箱內(nèi)常壓下再培養(yǎng)24小時，CCK-8試劑盒檢測細胞增殖率，確定實

6、驗細胞及壓力加載最適時間：壓力加載后1小時提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測Ⅰ型膠原與α-SMA的mRNA表達；壓力加載1小時，常壓下再培養(yǎng)24小時后，提取HSC總蛋白，Western-blot檢測TypeⅠcollagen、α-SMA和PCNA蛋白表達。 ㈣HSC細胞周期的檢測 在6cm培養(yǎng)皿內(nèi)按1×106cells/ml密度種植HSC，無血清培養(yǎng)基同步化24小時，按不同壓力加載1小時后，在培養(yǎng)箱內(nèi)常壓下再培養(yǎng)24小時，消

7、化收集細胞，PI染色，流式細胞儀檢測HSC細胞周期。 ㈤HSC細胞遷移的檢測 1．劃痕實驗：在6cm培養(yǎng)皿內(nèi)按1×106cells/ml密度種植HSC，無血清培養(yǎng)基同步化24小時，用Tip(1ml)尖端同一方向垂直劃痕，不同壓力加載1小時后，培養(yǎng)箱內(nèi)常壓下再培養(yǎng)24小時，顯微鏡下拍照，計算細胞遷移率=(作用前劃痕內(nèi)面垂直距離一作用后劃痕內(nèi)面垂直距離)/作用前劃痕內(nèi)面垂直距離×100％。 2．Transwell：在

8、24孔板Transwell小室中按5x103cells/well密度種植HSC，無血清DMEM同步化24小時，不同壓力加載1小時后，培養(yǎng)箱內(nèi)常壓下再培養(yǎng)24小時，含20％FBS的培養(yǎng)基趨化HSC24小時，結(jié)晶紫染色，計算遷移指數(shù)=底部細胞數(shù)目/(上部細胞+底部細胞)×100％。 三、壓力促HSC增殖活化與遷移的機制研究 選取10mmHg作用1小時為干預(yù)條件，應(yīng)用特異性阻斷劑HerbimycinA(HA，900nM)抑制S

9、rc的磷酸化；PD98059(25μM)抑制Erk1/2的磷酸化；LY294002(25μM)抑制Akt的磷酸化；RT-PCR檢測β3-integrin，F(xiàn)AK，ILK，ETA，PDGF-Breceptor，TGFβ1及TGFβ1receptor的mRNA表達變化；并用Western-blot分別檢測信號通路蛋白Phospho-Src(Tyr418)，Phospho-FAK(Tyr397)，Phospho-FAK(Tyr576/577)

10、，Phospho-Akt(Ser473)，Phospho-Erk1/2(Thr185/Tyr187)，Phospho-p70S6k(Thr421/Ser424)，F(xiàn)AK，p70S6k及增殖活化相關(guān)蛋白TypeⅠcollagen、α-SMA和PCNA的表達水平；Transwell方法檢測細胞的遷移能力。 四、統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準誤表示，數(shù)據(jù)由SPSS13.0軟件統(tǒng)計包處理。多組間的比較用One-WayANOVA方差

11、分析：方差齊性用LSD方法比較；方差不齊用Dunnett’s方法比較。P＜0.05認為有統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論： 一、壓力能顯著促進HSC的增殖、TypeⅠcollagen和α-SMA在mRNA與蛋白水平的表達、促進活化HSC的遷移能力，提示病理性升高的肝竇內(nèi)壓力能促進肝纖維化和門脈高壓的發(fā)展。 二、壓力促HSC增殖活化與遷移的作用與Integrin相關(guān)的FAK(Tyr397)自我磷酸化有關(guān)，其上游信號由Src介導(dǎo)，