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文檔簡(jiǎn)介
1、慢性肝臟疾病是一類世界性的嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病,其中肝纖維化是這個(gè)過(guò)程的中間及關(guān)鍵環(huán)節(jié)。肝纖維化(hepatic fibrosis)是慢性肝病的共同病理學(xué)基礎(chǔ),是形成肝硬化的必經(jīng)病理階段,其特征是以膠原為主的細(xì)胞外間質(zhì)(extracellular matrix,ECM)成分合成增多和/或降解相對(duì)不足而在肝內(nèi)過(guò)量沉積。盡管不同肝病的發(fā)病機(jī)制有所不同,但其發(fā)生纖維化的最終途徑相似,其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞(hepatic stel
2、late cells,HSCs)的激活。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)是啟動(dòng)整個(gè)事件的開端,在肝纖維化過(guò)程中扮演著重要的角色,誘導(dǎo)活化HSC的凋亡可使肝纖維化發(fā)生逆轉(zhuǎn)。越來(lái)越多的研究認(rèn)為HSC活化和增殖與其凋亡受到抑制有關(guān),而核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。NF-κB是一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強(qiáng)子κB序列特異合的蛋白因子,由Rel蛋白家
3、族的成員以同源或異源二聚體形式組成,目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物的Rel蛋白包括p65(RelA,NF-κB3)、p50(NF-κB1)、Rel(c-Rel)、RelB和p52(NF-κB2:),其中p65/p50是發(fā)現(xiàn)最早的,分布最廣泛,主要發(fā)揮生理作用的NF-κB。NF-κB能與多種細(xì)胞基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列特定位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和表達(dá),與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答以及細(xì)胞的增生、轉(zhuǎn)化和凋亡等重要的病理生理過(guò)程密切相關(guān)。誘導(dǎo)活化HSC的凋亡
4、可使肝纖維化發(fā)生逆轉(zhuǎn)。
雙環(huán)醇是中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制的抗肝炎新藥,其化學(xué)名稱為6-甲氧羰基15-羥甲基-2,3,2,3-雙亞甲二氧基4,4-二甲氧基聯(lián)苯。以往研究表明,雙環(huán)醇對(duì)多種實(shí)驗(yàn)性急、慢性肝損傷均有明顯保護(hù)作用。臨床用于治療慢性乙型、丙型病毒性肝炎已取得較好療效.且具有口服吸收好、不良反應(yīng)少的特點(diǎn),除此之外,雙環(huán)醇還可使肝纖維化大鼠血清ALT、AST、總膽紅素、透明質(zhì)酸(HA)和Ⅲ型前膠原肽(PⅢP)水平明顯
5、降低,白蛋白水平顯著增高.提示我們雙環(huán)醇可能通過(guò)下調(diào)HSC內(nèi)NF-κB的基因表達(dá),從而使HSC的凋亡增加,減緩肝纖維化的進(jìn)程。本文的主要目的是研究雙環(huán)醇對(duì)實(shí)驗(yàn)性HSC是否具有抗凋亡作用,從而為擴(kuò)大雙環(huán)醇臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
目的:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)用不同濃度的雙環(huán)醇對(duì)體外培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞的作用,研究其對(duì)腫瘤壞死因子-α(TNF-a)激活的肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡的影響。
方法:體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞,進(jìn)行以下分組:
6、按下列分組進(jìn)行處理:①對(duì)照組;②TNFa組;③雙環(huán)醇組④TNF-a+雙環(huán)醇。
應(yīng)用電泳遷移率改變實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)測(cè)定NF-κB活性變化;免疫熒光染色法(抗大鼠Cy3)測(cè)定NF-κB在HSCs中的分布;反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriotion polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制
7、因子-1(Timp-1)的mRNA的表達(dá);MTT方法測(cè)定HSCs增殖率;末段脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末段標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)檢測(cè)細(xì)
結(jié)果:
1.EMSA顯示對(duì)照組即可檢測(cè)出較高的NF-κB結(jié)合活性,TNF-a刺激后,NF-κB結(jié)合活性升高明顯(P<0.01
8、);雙環(huán)醇干預(yù)后,雙環(huán)醇組的NF-κB結(jié)合活性明顯下降(P<0.01);TNF-a+雙環(huán)醇組亦可檢測(cè)出較高的NF-κB結(jié)合活性,與TNF-a組比較無(wú)明顯減低,(P>0.05).
2.免疫細(xì)胞熒光染色法顯示:對(duì)照組及TNF-a組NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞較多,細(xì)胞形態(tài)正常,且在熒光顯微鏡下可以觀察到紅色的熒光,TNF-a組觀察到紅色的熒光強(qiáng)度高于對(duì)照組;雙環(huán)醇組陽(yáng)性細(xì)胞減少,并出現(xiàn)濃染致密的凋亡細(xì)胞。
3.反轉(zhuǎn)錄聚合酶
9、鏈反應(yīng)顯示:0.5mmol/L雙環(huán)醇組的HSC Timpl的mRNA表達(dá)減低,較TNF-a組顯著減低(P<0.01),與對(duì)照組及TNF-a+雙環(huán)醇組比較均減低,表明經(jīng)0.5mmol·L-雙環(huán)醇干預(yù)后Timpl的mRNA表達(dá)減低。
4.MTT方法測(cè)定顯示,與對(duì)照組相比TNF-a組在24h,48h和72h都有明顯差異,雙環(huán)醇組在48h(P<0.05)有明顯差異。與TNF-a組相比雙環(huán)醇組在24h,48h和72h都有明顯差異,T
10、NF-a和雙環(huán)醇合用組在24h,48h和72h亦有明顯差異。
5.雙環(huán)醇作用后的TNF-a激活的HSC凋亡增加:TUNEL法結(jié)果顯示24h,48h,72h三組0.5mmol·L雙環(huán)醇組細(xì)胞凋亡較TNF-a組增加(P<0.01),而48h,72h兩組之間的凋亡率無(wú)明顯差異(P>0.05)。
結(jié)論:
1.體外細(xì)胞培養(yǎng)研究表明,TNF-a可以刺激HSCs增殖并促進(jìn)NF-κB蛋白含量及結(jié)合活性的表達(dá);雙
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