枸杞多糖對(duì)糖尿病大鼠血—視網(wǎng)膜屏障的保護(hù)作用及ROCK通路表達(dá)的機(jī)理研究.pdf

1、目的：明確枸杞多糖（LBP）對(duì)糖尿病大鼠血-視網(wǎng)膜屏障的保護(hù)作用，進(jìn)一步探討枸杞多糖通過(guò)調(diào)控ROCK信號(hào)通路及其底物P-MLC的表達(dá)，減少血-視網(wǎng)膜屏障滲漏的作用機(jī)制。
　　 材料與方法：實(shí)驗(yàn)一.取健康雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為3組：CON組：正常對(duì)照組；DM組： STZ造模；LBP組： STZ造模成模后予以LBP（250mg/Kg·d）灌胃，DM組予以等量的生理鹽水灌胃。分別于4w、8w、12w抽取靜脈血，并取眼球。實(shí)驗(yàn)二.

2、健康成年雄性（SD）大鼠54只，分組及給藥方法取材時(shí)間同實(shí)驗(yàn)一，采用HE染色光鏡觀察各組大鼠視網(wǎng)膜各層組織細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)變化。實(shí)驗(yàn)三.健康成年雄性（SD）大鼠44只，隨機(jī)分為5組，CON組、DM組、LBP組給藥方法取材時(shí)間同實(shí)驗(yàn)一，F(xiàn)組：成模后法舒地爾（Fasudil）腹腔注射（15mg/kg），L+F組：成模后LBP灌胃+Fasudil腹腔注射，各組于8w取材。分別用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Occludin、ROCK1表達(dá)情況進(jìn)行半定量分

3、析。實(shí)驗(yàn)四.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞RF/6A，MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，按照1:2～1:4進(jìn)行傳代。分組檢測(cè)：共分5組，正常對(duì)照組：含葡萄糖5.5mmol/L；高糖1組：含葡萄糖30mmol/L；高糖2組：含葡萄糖40mmol/L；LBP+高糖1組：含葡萄糖30mmol/L+LBP（1g/L）；LBP+高糖2組：含葡萄糖40mmol/L+LBP（1g/L）；于1d、3d、5d、7d進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 1.LBP對(duì)DM

4、大鼠血糖、血脂及血-視網(wǎng)膜屏障滲漏的影響：
　　 （1）血糖變化：LBP干預(yù)后的各組大鼠對(duì)應(yīng)同時(shí)期的DM大鼠的血糖均有明顯下降，4w時(shí)血糖下降幅度為57％，8w時(shí)下降幅度為40％，12w血糖下降幅度為36％，其降血糖效果以4w最為明顯，隨著病情的進(jìn)展LBP的降糖效果有所減弱，下降率基本穩(wěn)定在35％～40％之間。
　　 （2）體重的變化：DM組成模后，開始出現(xiàn)消瘦，體重下降或增加緩慢，明顯低于相同時(shí)間段的其他兩組大鼠的體重

5、。而LBP組則體重與正常對(duì)照組比較略有下降，明顯好于DM組。
　　 （3）血脂的變化：DM組12w時(shí)甘油三酯基本達(dá)到正常值的3倍，而LBP組12w時(shí)甘油三酯的濃度有輕度上升。12w時(shí)DM組總膽固醇濃度是正常對(duì)照組的1.4倍；而LBP組膽固醇濃度與正常組基本無(wú)差異p>0.05。
　　 （4）EB在血-視網(wǎng)膜屏障滲漏的變化：DM組大鼠EB滲漏量4w、8w、12w分別增加了2.1倍、2.3倍、2.7倍。而枸杞多糖組較糖尿病組以

6、上三個(gè)時(shí)間點(diǎn)EB滲透量降低了50％、40％、27％，組間比較p<0.01。前4w保護(hù)作用表現(xiàn)就的最明顯。
　　 2.LBP對(duì)DM大鼠血-視網(wǎng)膜屏障形態(tài)學(xué)變化的影響：
　　 （1）HE染色光鏡觀察:12wDM組神經(jīng)纖維層斷裂明顯；節(jié)細(xì)胞、內(nèi)顆粒層細(xì)胞排列明顯紊亂；毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張，數(shù)量增加。4wLBP組、8wLBP組各層組織形態(tài)與正常組織基本無(wú)明顯差別，12wLBP組僅出現(xiàn)內(nèi)、外顆粒層排列稍有不規(guī)則，毛細(xì)血管的輕度擴(kuò)張。<

7、br>　　 （2）視網(wǎng)膜血管鋪片:12w DM組毛細(xì)血管網(wǎng)迂曲，扭結(jié)，某些部位出現(xiàn)節(jié)段性膨大，管腔狹窄甚至閉塞。周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞有所減少；12wCON、DM、LBP組VEGF灰度值216.13±2.71、105.30±4.25、176.72±4.31。組間有明顯差異p<0.05，DM組并隨著病程的進(jìn)展，VEGF表達(dá)的量不斷增高。
　　 （3）電鏡下超微結(jié)構(gòu)的改變:12w DM組大鼠視網(wǎng)膜基底膜進(jìn)一步增厚，血管內(nèi)皮細(xì)胞及周細(xì)胞腫

8、脹，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹變性，管腔可出現(xiàn)擴(kuò)張。視桿細(xì)胞膜盤模糊，出現(xiàn)溶解、斷裂，間隙進(jìn)一步擴(kuò)大。12w LBP胞質(zhì)內(nèi)部分線粒體輕度腫脹變性，基底膜增厚不明顯，毛細(xì)血管壁完整，管腔無(wú)擴(kuò)張。視桿細(xì)胞，膜盤結(jié)構(gòu)略有些模糊，結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)紊亂，但紋理尚清。
　　 3.枸杞多糖對(duì)糖尿病大鼠血-視網(wǎng)膜屏障保護(hù)作用機(jī)理的研究：
　　 （1）免疫組化法檢測(cè)的Occludin表達(dá)：主要分布在視網(wǎng)膜內(nèi)五層上?；叶戎?2w時(shí)，CON組143.70±

9、2.29；DM組173.18±3.78；LBP組153.02±3.59，DM組表達(dá)較正常對(duì)照組顯著減少。隨著糖尿病視網(wǎng)膜病變時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降。8w各治療組與DM組比較，Occludin表達(dá)量明顯增加。F+L組效果最好（p<0.05），LBP與Fasudil組之間無(wú)明顯差異（p>0.01）。
　　 （2）免疫組化法檢測(cè)的ROCK1表達(dá)：主要分布在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)顆粒層，灰度值12w時(shí)，CON組178.32±5.92；DM組15

10、5.91±2.76；LBP組178.82±4.33，DM組從4w開始減弱，并隨著病程的延長(zhǎng)，ROCK1表達(dá)的量逐漸增加，而LBP組ROCK表達(dá)量并沒有明顯的增加。各治療組間比較，F(xiàn)+L組與正常組無(wú)明顯差異（p>0.05），治療效果最好，F(xiàn)asudil組的作用要比LBP的效果明顯一些（p<0.05）。
　　 （3）免疫印跡法檢測(cè)Occludin蛋白表達(dá)：DM組隨著病程的延長(zhǎng)，Occludin蛋白的量逐漸下降，組間有明顯差異p<0.

11、01，而LBP組3.57±0.58；F組3.65±0.71；F+L組4.48±0.53，LBP組與F組比較LBP組表達(dá)略低，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P>0.05。F+L組表達(dá)量高于其他兩治療組p<0.01，與CON組相接近。
　　 （4）免疫印跡法檢測(cè)ROCK1蛋白表達(dá)：各組DM組大鼠ROCK蛋白表達(dá)隨著病程的延長(zhǎng)量逐漸上升，組間有明顯差異p<0.01；而LBP組3.14±0.51；F組3.05±0.42；F+L組2.62±0.51，

12、LBP組與F組比較LBP組表達(dá)略高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p<0.05。F+L組表達(dá)量高于其他兩治療組p<0.01，與CON組相接近。
　　 （5）免疫印跡法檢測(cè)P-MLC蛋白表達(dá)：各組DM組大鼠ROCK蛋白表達(dá)隨著病程的延長(zhǎng)量逐漸上升，組間有明顯差異p<0.01，而LBP組2.97±0.42；F組2.78±0.53；F+L組2.44±0.47，LBP組與F組比較LBP組表達(dá)略高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p>0.05。F+L組表達(dá)量高于其他兩治療組p

13、<0.01，與CON組相接近。
　　 4.枸杞多糖對(duì)高糖培養(yǎng)下視網(wǎng)膜血管皮細(xì)胞Rho/ROCK信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響：
　　 （1）正常RF/6A呈單層扁平上皮狀，高糖2組7d組內(nèi)皮細(xì)胞收縮明顯，有的伸出長(zhǎng)長(zhǎng)的偽足，邊界模糊，細(xì)胞間形成明顯的裂隙，細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)量明顯較對(duì)照組少。高糖1組則于5d后形態(tài)開始出現(xiàn)變化。而LBP+高糖1組、LBP+高糖2組，僅于7d時(shí)，細(xì)胞略有些變圓，細(xì)胞數(shù)量略少。
　　 （2）RF/6As單

14、層通透性的變化：3、5、7 d高糖組HRP的光密度值明顯高于正常對(duì)照組（p<0.01），尤其高糖2組滲漏更加明顯。而LBP則能逆轉(zhuǎn)這種因高糖造成的滲漏（p<0.01）。尤以LBP+高糖1組效果較理想，與對(duì)應(yīng)的高糖1組通透性明顯降低（p<0.01）。
　　 （3）F-actin形態(tài)及分布的變化：對(duì)照組F-actin分布均勻，呈網(wǎng)狀有序排列，細(xì)胞相互融合，連接緊密。高糖2組7d外周致密帶明顯斷裂，胞質(zhì)內(nèi)應(yīng)力纖維斷裂，細(xì)胞周邊出現(xiàn)“絨

15、毛狀”短的指狀突起，“空洞狀”裂隙增大，細(xì)胞近似脫落狀態(tài)。LBP+高糖2組7d外周致密帶進(jìn)一步變細(xì)，并且部分出現(xiàn)斷裂，細(xì)胞間開始出現(xiàn)裂隙，但細(xì)胞形態(tài)明顯好于高糖7d組。
　　 （4）ROCK1蛋白表達(dá)量：隨葡萄糖濃度的增加而升高，與β-actin的光密度比值，正常組0.54±0.25、高糖1組0.85±0.31、高糖2組1.32±0.38，高糖1組和高糖2組與對(duì)照組比較p<0.01，而這種增高趨勢(shì)能被LBP所逆轉(zhuǎn)，在葡萄糖濃度為

16、30mmol/L的條件下LBP抑制ROCK1表達(dá)的作用更明顯。
　　 （5）P-MLC蛋白表達(dá)量：表達(dá)量隨葡萄糖濃度的增加而升高，與β-actin的光密度比值，正常組1.34±0.25、高糖1組2.45±0.31、高糖2組3.32±0.38，高糖1組和高糖2組與對(duì)照組比較p<0.01，LBP抑制P-MLC表達(dá)的升高，LBP+高糖1組1.38±0.27，LBP+高糖2組1.87±0.51。
　　 （6）Occludin蛋白

17、表達(dá)量：隨著葡萄糖濃度的增加Occludin蛋白表達(dá)量逐漸下降，LBP-高糖1組0.90±0.16，LBP-高糖2組0.69±0.14，各治療組均可明顯提升其相對(duì)應(yīng)高糖組Occludin表達(dá)的量，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p<0.01，尤其LBP-高糖1組可明顯抑制Occludin表達(dá)的量的下降。
　　 結(jié)論：
　　 1.LBP可以顯著減低糖尿病大鼠的血糖、血脂并能降低血-視網(wǎng)膜屏障的滲漏。
　　 2.LBP可以減低糖尿病

18、大鼠的視網(wǎng)膜血管上VEGF的表達(dá)，并能減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的水腫，減少基底膜的增厚，并減輕視細(xì)胞的損害。
　　 3.DR的過(guò)程中確實(shí)存在著ROCK通路的激活，ROCK及其底物P-MLC表達(dá)的上調(diào)。而該過(guò)程可以被LBP所阻斷，減低以上信號(hào)分子的表達(dá)，通過(guò)穩(wěn)定Occludin的表達(dá)，起到保護(hù)血-視網(wǎng)膜屏障的作用。
　　 4.LBP可以明顯減輕體外高糖環(huán)境培養(yǎng)下的單層EC的滲漏，通過(guò)抑制ROCK及其底物P-MLC該信號(hào)通路