ω-3脂肪酸后處理對大鼠缺血再灌注心肌抗氧化作用的影響.pdf

1、1、背景
　　 缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusioninjury，IRI)是指缺血期處于可逆損傷的組織細(xì)胞經(jīng)恢復(fù)血液再灌注后，損傷加重或轉(zhuǎn)化為不可逆性損傷。隨著臨床心臟外科體外循環(huán)手術(shù)及冠脈內(nèi)溶栓、經(jīng)皮穿刺冠狀動脈腔內(nèi)介入治療(percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty，PTCA)的廣泛開展，心肌IRI已成為一個普遍的臨床問題，愈來愈引起心臟專科醫(yī)生的重視。IRI是

2、一個涉及多種機(jī)制的復(fù)雜病理生理過程，一般認(rèn)為主要有以下幾種作用機(jī)制:1、自由基反應(yīng);2、細(xì)胞內(nèi)鈣超載;3、白細(xì)胞積聚;4、高能磷酸化合物缺乏;5、無復(fù)流現(xiàn)象等等。1986年Murry等發(fā)現(xiàn)狗心臟多次短暫的缺血可以減輕隨后較長時間的缺血再灌注帶來的心肌損傷，由此提出缺血預(yù)處理(ischemicpreconditioning，IPC)的概念，認(rèn)為心肌IPC可以提高心肌細(xì)胞自身抗損傷的耐受性或適應(yīng)性，減輕心肌IRI。后來大量的實驗研究也印證了

3、心肌IPC可以起到明確的心肌保護(hù)作用。但由于這種預(yù)處理需要在發(fā)生缺血前進(jìn)行，使其臨床應(yīng)用價值大大受限。盡管心肌保護(hù)已經(jīng)發(fā)展了多年，但現(xiàn)有的心肌保護(hù)措施大部分都屬于針對擇期心臟手術(shù)的預(yù)防性保護(hù)，而心臟專科的特點就是起病的突然性和嚴(yán)重性(如急性心肌梗死或急診心臟手術(shù))，對于此類病人，發(fā)病時其心臟功能往往已經(jīng)很差，而手術(shù)治療不可避免的會產(chǎn)生心肌IRI，導(dǎo)致其心臟功能進(jìn)一步惡化，所以心肌保護(hù)的意義顯得尤為重要，但面對這樣的情況大部分傳統(tǒng)的心肌保

4、護(hù)措施因為失去了應(yīng)用的時機(jī)而顯得作用有限。針對已缺血心肌，如何設(shè)法減輕再灌注損傷，成為心肌保護(hù)研究的一個難點。2003年Zhao等發(fā)現(xiàn)心肌缺血后在再灌注前進(jìn)行短暫的心肌缺血再灌注也能對抗隨后的心肌IRI，并能起到和IPC同樣的心肌保護(hù)效果，于是提出了缺血后處理(ischemicpostconditioning，IP)的概念，為IRI的防治提供了一個新的思路及方向。后處理作用機(jī)制涉及活性氧(reactiveoxygenspecies，RO

5、S)、內(nèi)源性自身激活物、線粒體ATP敏感性鉀通道、一氧化氮、再灌注損傷補(bǔ)救激酶途徑(reperfusioninjurysalvagekinases，RISK)、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpore，MPTP)等多方面作用。研究發(fā)現(xiàn)對已缺血的心肌于再灌注開始時給予適量藥物，可產(chǎn)生類似于后處理的心肌保護(hù)作用，即藥物模擬后處理。而藥物模擬后處理的可操作性明顯強(qiáng)于常規(guī)意義上的IP，因

6、此具有更為廣泛的應(yīng)用前景。已有學(xué)者將其應(yīng)用于臨床，并取得了較好的心肌保護(hù)效果。但目前文獻(xiàn)報道用于模擬后處理的藥物并不多，主要有腺苷、阿片類物質(zhì)、揮發(fā)性麻醉藥物等，且由于藥物本身的副作用(如阿片類物質(zhì))或藥物本身的特點(如揮發(fā)性麻醉藥物)，使其臨床應(yīng)用受到了較大的限制;而腺苷只是從改善心肌細(xì)胞能量代謝方面發(fā)揮一定的作用，作用途徑較單一。尋找更加安全有效、便于臨床應(yīng)用的IP藥物，無疑具有重要的臨床實用價值。
　　 ω-3脂肪酸屬于多

7、不飽和脂肪酸，主要包括α-亞麻酸、二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，DHA)等。近年來，ω-3脂肪酸的心臟保護(hù)作用引起了越來越多的重視。大規(guī)模的臨床試驗證明每日攝入500mg到1000mg的多不飽和脂肪酸可顯著的減少心血管事件的發(fā)生幾率。研究表明，ω-3脂肪酸具有免疫調(diào)節(jié)功能、抑制炎癥反應(yīng)、抗心律失常及抗血栓的作用。眾所周知，心臟手術(shù)體外循環(huán)過程中血

8、液直接接觸異物表面、手術(shù)創(chuàng)傷，器官缺血再灌注導(dǎo)致白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞激活、體溫變化、腸道內(nèi)毒素釋放等均可引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征，炎性細(xì)胞因子、補(bǔ)體、中性粒細(xì)胞相繼被激活，造成術(shù)后心功能受損，全身重要器官功能不良。因此，ω-3脂肪酸可以通過抑制全身及局部的炎癥反應(yīng)達(dá)到保護(hù)心臟功能的作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)ω-3脂肪酸還可通過作用于心肌細(xì)胞的離子通道、離子泵、交換體及影響細(xì)胞膜的穩(wěn)定、氧化應(yīng)激等發(fā)揮其心肌保護(hù)的作用。ω-3脂肪酸以游離脂肪酸形式直

9、接溶于細(xì)胞漿膜磷脂易感應(yīng)的疏水性內(nèi)側(cè)面，可降低細(xì)胞膜電興奮性，一定程度上起到細(xì)胞膜電穩(wěn)定的作用;同時心肌細(xì)胞膜磷脂的ω-3脂肪酸含量增加，使ω-6脂肪酸含量相對減少，能增加膜穩(wěn)定性，并影響心肌細(xì)胞的各種離子通道、交換體等，最終減輕心肌IRI。亦有研究報道ω-3脂肪酸可以減少心肌耗氧量，減少心肌缺血再灌注時氧化應(yīng)激及K+的丟失，從而減少再灌注性心律失常。在臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，ω-3脂肪酸可增加血漿氧化脂質(zhì)復(fù)合物和超活性氧化物的濃度，其中包括自

10、由基和過氧化物酶等，有學(xué)者認(rèn)為這相當(dāng)于激活了人體的生存信號傳導(dǎo)通路而達(dá)到了IPC的效果，從而效地減輕了發(fā)生心肌梗死或體外循環(huán)時缺血再灌注對心肌細(xì)胞的損傷。研究還發(fā)現(xiàn)ω-3脂肪酸可以調(diào)節(jié)新生鼠心肌細(xì)胞的相關(guān)下游基因表達(dá)從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞基質(zhì)的重構(gòu)、鈣離子的釋放和超活性氧化反應(yīng)物的生成，這可能是ω-3脂肪酸發(fā)生心肌保護(hù)作用的重要機(jī)制。McGuinness等在新西蘭白兔心肌缺血再灌注模型中發(fā)現(xiàn)，ω-3脂肪酸預(yù)處理還可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞熱休克蛋

11、白(heatshockprotein，HSP)的大量表達(dá)，降低了心肌梗死面積。但目前對ω-3脂肪酸的研究大部分都還是集中在其預(yù)處理對心肌的保護(hù)作用。聯(lián)系到心肌IRI的幾種發(fā)病機(jī)制，我們看到，ω-3脂肪酸在這幾個方面都可能發(fā)揮作用，減輕心肌IRI，有希望作為一種安全有效的IP藥物應(yīng)用于臨床心肌IRI的防治。
　　 2、目的
　　 利用離體大鼠心臟缺血再灌注模型，研究ω-3脂肪酸后處理是否能提高離體大鼠心臟缺血再灌注期間的抗

12、氧化能力，并通過對心肌細(xì)胞梗死面積及線粒體超微結(jié)構(gòu)損害程度的比較來判斷ω-3脂肪酸后處理是否能產(chǎn)生有效的心肌保護(hù)作用，探討其可能的作用機(jī)制，為尋找一種可安全有效地應(yīng)用于臨床心肌IRI防治的藥物提供理論及實驗依據(jù)。
　　 3、材料與方法
　　 3.1、建立Langendorff離體大鼠心臟缺血再灌注模型
　　 3.2、實驗動物分組:SPF級雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為4組，每組15只
　　 3.2.1、持續(xù)

13、灌注組(A組):持續(xù)灌注150min;
　　 3.2.2、缺血再灌注組(B組):灌注30min，缺血30min后再灌注90min;
　　 3.2.3、缺血后處理組(C組):灌注30min，缺血30min后再灌注90min，在再灌注開始前進(jìn)行4個循環(huán)復(fù)灌20s/缺血20s;
　　 3.2.4、ω-3脂肪酸后處理組(D組):灌注30min，缺血30min后再灌注90min，在再灌注開始前用ω-3脂肪酸的靜脈制劑ω-3

14、魚油脂肪乳灌注15min，ω-3魚油脂肪乳的終濃度為1:400(v/V)。
　　 3.3、觀察指標(biāo)及方法
　　 3.3.1、每組各取5只大鼠取左心室游離壁心肌組織檢測灌流結(jié)束后心肌細(xì)胞氧化損傷和抗氧化指標(biāo):考馬斯亮蘭法測蛋白含量，超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)采用黃嘌呤氧化酶法測定，丙二醛(malondialdehyde，MDA)采用硫代巴比妥酸法測定，乳酸脫氫酶(lactatedehy

15、drogenase，LDH)采用可見光分光光度計法測定;
　　 3.3.2、每組各取5只大鼠將心臟由心尖部向心底部切成1mm厚的薄片，TTC染色后存活心肌呈磚紅色，梗死區(qū)不著色呈灰白色，置于玻片上，拍照后以ImageJ1.37軟件計算心肌梗死面積百分比;
　　 3.3.3、灌流結(jié)束后每組各取5只大鼠心臟心尖部組織進(jìn)行處理并利用電子顯微鏡觀察心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)及損傷程度。
　　 4、結(jié)果
　　 4

16、.1、與A組比較，心肌缺血再灌注后B、C、D組大鼠心肌細(xì)胞的LDH及MDA升高(P＜0.05)，SOD降低(P＜0.05)。與B組比較，C組的SOD雖然有所升高，MDA有所降低，但與B組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.165、P=0.056);而與B組比較，D組的SOD升高及MDA、LDH降低均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.049、P=0.049、P=0.000)。
　　 4.2、各組心肌梗死面積百分比為:A組(11.14±3.09)

17、％，B組(34.15±3.06)％，C組(26.94±2.73)％，D組(23.28±2.60)％。與B組比較，A組、C組及D組減少大鼠心肌梗死面積結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000，P=0.007，P=0.000)，C組與D組組間比較無明顯差異性(P=0.368)。
　　 4.3、將不同處理組的大鼠心肌組織置于透射電鏡下放大11500倍觀察，可見A組大鼠心肌線粒體體積基本正常，包膜完整，嵴排列整齊、連續(xù)，基質(zhì)密度正常，肌纖維無明

18、顯水腫、斷裂;B組心肌細(xì)胞線粒體大量腫脹變形，嵴數(shù)量明顯減少，斷裂、溶解成空泡狀，線粒體基質(zhì)電子密度降低，部分線粒體基質(zhì)濃縮，電子密度加深而線粒體體積變小，肌纖維斷裂、溶解;C組線粒體結(jié)構(gòu)和B組相比病變有所改善，但仍有部分線粒體腫脹變形，嵴斷裂，部分線粒體內(nèi)有空泡形成;D組的損傷進(jìn)一步減輕，大部分線粒體正常，僅見個別線粒體輕度腫脹、嵴數(shù)量減少，無明顯斷裂、溶解。
　　 5、結(jié)論
　　 ω-3脂肪酸后處理可有效提高離體大鼠