缺血后處理對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注膽管細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：通過建立大鼠肝臟缺血再灌注模型，觀察缺血后處理(ischemicpostconditioning,IPO)在肝臟缺血再灌注損傷(ischemiareperfusion,IR)中對(duì)膽管細(xì)胞的保護(hù)作用。探討缺血后處理抑制膽管細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為臨床中肝臟缺血再灌注時(shí)減輕膽道的損傷提供更加有效的措施及理論機(jī)制。
　　方法：
　　1、模型制備：24只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，體重200g-300g，隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(sham

2、–operation，SO組)、缺血再灌注組(ischemiareperfusion，IR組)、缺血后處理組(ischemicpostconditioning，IPO組),每組8只。各組SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)l周，術(shù)前12小時(shí)內(nèi)禁食，自由進(jìn)水。均采取0.3％戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉成功后，將大鼠平臥位固定于手術(shù)臺(tái)，備皮消毒。所有手術(shù)操作均在無菌條件下進(jìn)行。1）.假手術(shù)組（SO組）：大鼠麻醉后，常規(guī)備皮、消毒，鋪無菌巾，于

3、上腹部正中取一長約3-4厘米（能使肝臟充分顯露即可）縱行切口，將腹壁各層依次切開，肝臟顯露后進(jìn)一步游離出肝十二指腸韌帶關(guān)腹，無其他干預(yù)。目的是作為正常對(duì)照組以排除手術(shù)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。2）.缺血再灌注組（IR組）：在SO組基礎(chǔ)上，游離肝十二指腸韌帶后，模擬Pringle法，用無損傷動(dòng)脈夾將肝門區(qū)域夾閉，造成肝臟缺血，缺血30min后取下血管夾，使血管開放，對(duì)肝臟行持續(xù)再灌注，最后關(guān)腹。3）.缺血后處理組（IPO組）：在IR組基礎(chǔ)上，

4、血供完全恢復(fù)之前再灌注10秒，夾閉10秒，如此反復(fù)行6個(gè)循環(huán)（共2分鐘）后完全恢復(fù)血供。
　　2、各組大鼠于術(shù)后4小時(shí)候進(jìn)行標(biāo)本采集，采血器經(jīng)心臟采血后，常溫下靜置30min，然后放入離心機(jī)3000r/min，離心15min，離心完成后提取血清標(biāo)本，存放于-80℃冰箱保存，待檢測超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase，SOD）活力、r-谷氨酰胺轉(zhuǎn)酞酶（Glutamyltranspeptidase，r-GT）活性。同

5、時(shí)于肝門部位取肝組織標(biāo)本，置于10%中性福爾馬林溶液固定24小時(shí)后，石蠟包埋，備檢。
　　3、應(yīng)用比色法檢測血清SOD及r-GT水平。
　　4、用HE染色法觀察、比較膽管細(xì)胞的形態(tài)變化；
　　5、應(yīng)用免疫組化法檢測膽管細(xì)胞Bcl-2及Bax的表達(dá)水平；
　　6、脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatedd-UTPnickend

6、labeling,TUNEL)檢測膽管細(xì)胞凋亡，并計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptosisindex,AI)。
　　7、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用spss13.0軟件進(jìn)行處理，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用方差分析SNK法，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　(1)HE染色結(jié)果顯示：SO組肝組織中肝細(xì)胞條理整齊，肝小葉的結(jié)構(gòu)未見損壞，匯管區(qū)正常，膽管的結(jié)構(gòu)無異常，偶可見少量中性粒細(xì)胞的浸潤。IR組則

7、可見部分肝小葉無清晰的結(jié)構(gòu)顯現(xiàn)，在中央靜脈的周圍可見壞死的大片的肝細(xì)胞，匯管區(qū)肝內(nèi)膽管可見上皮細(xì)胞的損傷，并伴有大量的炎性細(xì)胞的浸潤，細(xì)胞凋亡較多。IPO組病理改變較IR組明顯減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，肝細(xì)胞變性的程度減輕，匯管區(qū)炎性浸潤較輕，膽管上皮連續(xù)完整，炎細(xì)胞浸潤少。
　　(2)反應(yīng)膽管上皮細(xì)胞損傷的標(biāo)志物r-GT在假手術(shù)組活力值最低，IR組最高，IPO組活力值較SO組升高，但較IR組減低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0

8、5）。
　　(3)血清中SOD的表達(dá)水平顯示SOD的活力值在各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　(4)抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)：SO組膽管組織中Bcl-2陽性表達(dá)率低于IR組及IPO組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。IR組膽管Bcl-2陽性表達(dá)率低于IPO組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(5)促細(xì)胞凋亡蛋白Bax的表達(dá)：IR組及IPO組Bax陽性表達(dá)率高于SO組，IPO組的陽性表達(dá)率

9、低于IR組，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(6)膽管組織細(xì)胞凋亡水平：SO組膽管組織中僅可見有少量凋亡細(xì)胞表達(dá)，凋亡指數(shù)為26.06±2.27，而在IR組中凋亡細(xì)胞數(shù)量增強(qiáng)，凋亡指數(shù)為79.31±1.12，兩者AI比較其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IPO組凋亡指數(shù)為58.90±2.75，且IPO組和IR組相比較凋亡細(xì)胞減少，AI下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但未降至SO組水平，二者AI比較差異亦