以脂肪細(xì)胞分泌因子脂聯(lián)素為靶點(diǎn)的具有減肥作用中藥的初步篩選.pdf

1、　　目的：肥胖癥嚴(yán)重危害著人們的健康,與糖尿病(DM)、冠心病(CHD)、高血壓(HBP)、脂代謝紊亂及動(dòng)脈粥樣硬化(AS)等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。脂肪組織的變化是肥胖癥發(fā)生的根本原因,脂聯(lián)素(adiponectin,ADI)是由脂肪組織分泌的一種特異性蛋白,在機(jī)體糖脂代謝中起著重要的調(diào)節(jié)作用,亦成為治療肥胖的新靶點(diǎn)。本課題以3T3-L1細(xì)胞系為工具,利用分子生物學(xué)技術(shù),從30味中藥中篩選對人ADI基因啟動(dòng)子表達(dá)有影響的藥物,進(jìn)一步探明此

2、類中藥治療肥胖的分子生物學(xué)機(jī)理,為臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.制備 30 種不同濃度中藥水溶性提取物(Extracts of Chinese Medical Herbs, ECMH ),常規(guī)體外培養(yǎng)小鼠前體脂肪細(xì)胞3T3-L1,分別以濃度為(0.001、0.01、0.1、1、10)mg/ml 的 ECMH 刺激 3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞 24h,通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)和 MTT 法初步篩選出對細(xì)胞有影響但

3、損傷較小的最高藥物濃度進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)；
　　2 .采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(realtime fluorescence quantitative PCR , RT-PCR)技術(shù)分別檢測30種ECMH對小鼠3T3-L1前體脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞分泌因子ADI mRNA水平的影響,根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果篩選數(shù)味藥進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)；
　　3.利用 PCR 技術(shù)從人全血基因組 DNA 中分別擴(kuò)增出 1.1kb 和 2.1kb 長度的AD

4、I 基因啟動(dòng)子片段,經(jīng)純化酶切后克隆入載體熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Basic 中,形成重組質(zhì)粒 ADI promoter1.1-pGL3-Basic 和 ADI promoter 2.1-pGL3-Basic,以pcDNA3.1-EGFP為對照載體,在脂質(zhì)體(lipofectamine 2000)介導(dǎo)下將以上4個(gè)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到3T3-L1前體脂肪細(xì)胞中,以此為工具,將24h后加入(0.01、0.1、1)mg/ml的ECMH刺激此細(xì)

5、胞模型24h,收集細(xì)胞,測其熒光素酶活性,篩選出對人ADI啟動(dòng)子表達(dá)有影響的藥物。
　　結(jié)果：
　　1.ECMH刺激3T3-L1前體脂肪細(xì)胞24h后均使細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化,MTT法檢測顯示不同濃度 ECMH 不同程度抑制 3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞增殖,且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,各藥10mg/ml ECMH作用于細(xì)胞均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05),除生地、大棗、澤瀉、梔子外,1mg/ml ECMH均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.

6、05),結(jié)合各藥各濃度ECMH對細(xì)胞形態(tài)影響,確定細(xì)胞給藥濃度為1mg/ml；
　　2.利用RT-PCR技術(shù)測定了濃度為1mg/ml ECMH對誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的3T3-L1細(xì)胞 ADI mRNA 表達(dá),結(jié)果顯示,番瀉葉、黃芩和首烏 ECMH 明顯促進(jìn) 3T3-L1 前 體脂肪細(xì)胞ADI mRNA的表達(dá) (P﹤0.05),羅布麻、首烏、番瀉葉、荷葉、黃芩、柴胡、大黃、枸杞、山楂 ECMH 不同程度促進(jìn) 3T3-L1 成熟脂肪細(xì)胞

7、 ADI mRNA 的表達(dá) (P﹤0.05),初步篩選出以上9味藥；
　　3.從人全血基因組 DNA 中 PCR 擴(kuò)增得到長為 1.1kb(-1066 To +4bp)和2.1kb(-2114 To +4bp)長度的ADI基因啟動(dòng)子片段,并將其克隆到熒光素酶報(bào)告基因載體 pGL3-Basic 上,構(gòu)建了 2 種重組質(zhì)粒,將其命名為 ADI promoter 1.1-pGL3-Basic和ADI promoter 2.1-pGL

8、3-Basic,測序證實(shí)所插入的目的片段與GenBank檢索的人ADI啟動(dòng)子序列99.6%匹配；
　　4.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 24h 后即可在熒光顯微鏡下觀察到 pcDNA3.1-EGFP 組發(fā)出綠色熒光,提示轉(zhuǎn)染效率較高,成功獲得表達(dá)熒光素酶活性的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的 3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞系,(0.01、0.1、1)mg/ml的 RT-PCR初篩的 9味 ECMH刺激此細(xì)胞模型24h后,番瀉葉、大黃、黃芩、山楂對人ADI基因啟動(dòng)子1.1k

9、b熒光素酶活性有影響(P﹤0.05),但未檢測出人ADI基因啟動(dòng)子2.1kb熒光素酶活性。
　　結(jié)論：
　　1.不同藥物不同濃度ECMH均不同程度地影響前體脂肪細(xì)胞的增殖分化,同時(shí)影響小鼠ADI mRNA表達(dá)水平。
　　2.表達(dá)熒光素酶活性的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的3T3-L1前體脂肪細(xì)胞模型的建立,可以靈敏、快捷、高效地從眾多中草藥中篩選出對人ADI基因啟動(dòng)子熒光素酶活性表達(dá)有影響的藥物。
　　3.番瀉葉、大