以微管為靶點(diǎn)的苯并呋喃類木脂素衍生物抗腫瘤細(xì)胞增殖活性及作用機(jī)理研究.pdf

1、惡性腫瘤是當(dāng)前危害人類健康的主要疾病之一。目前治療腫瘤的方法主要有手術(shù)、放射、藥物和免疫療法?；瘜W(xué)藥物治療是腫瘤治療中發(fā)展最快的一個(gè)領(lǐng)域，在腫瘤的治療中發(fā)揮著越來(lái)越大的作用。然而，化療藥物的毒副反應(yīng)及腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的抗藥性嚴(yán)重影響了化學(xué)治療的效果。因此，尋找高效低毒的新型抗癌藥物是當(dāng)務(wù)之急。 在長(zhǎng)期的抗癌藥物篩選實(shí)踐中人們發(fā)現(xiàn)，從植物中開(kāi)發(fā)新的抗腫瘤藥物具有極大的潛力。近幾十年來(lái)，研究者們發(fā)現(xiàn)了多種重要的抗腫瘤天然產(chǎn)物，如長(zhǎng)春堿

2、、長(zhǎng)春新堿、紫杉醇、鬼臼毒素及其衍生物等。目前臨床上用于治療腫瘤的植物藥已篩選出二十余種，分別為生物堿類(如長(zhǎng)春堿類、三尖杉酯堿類、喜樹(shù)堿類等)、木脂素類(如鬼臼毒素半合成衍生物)、柄型大環(huán)化合物(如美登木素)、二萜類化合物(如紫杉醇、雷公藤內(nèi)酯及冬凌草甲素等)。從作用機(jī)制來(lái)看，這些植物藥分別作用于微管系統(tǒng)，如長(zhǎng)春堿類及紫杉醇；或作用于拓?fù)洚悩?gòu)酶，如喜樹(shù)堿類及鬼臼毒素衍生物；有的則通過(guò)影響核糖體功能阻止蛋白質(zhì)合成，如三尖杉酯堿類。

3、 在上述各類抗腫瘤植物藥中，木脂素類化合物以其顯著的生物活性引起了廣泛關(guān)注。木脂素是一類由苯丙素雙分子氧化聚合而成的天然產(chǎn)物，廣泛存在于多種高等植物的根、莖、葉、種子和果實(shí)中。木脂素的生物活性廣泛而顯著，主要包括：抗腫瘤作用、肝臟保護(hù)和抗氧化作用、抗微生物作用、抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用、血小板活化因子(PAF)拮抗活性以及PKC抑制活性、抗焦慮作用等。在各種類型的木脂素中，苯并呋喃類木脂素占據(jù)著重要地位，這類木脂素均含有苯并呋喃結(jié)構(gòu)骨架，具

4、有多種生理活性，如抗增殖、抗血管生成、抗血栓、抗氧化以及心血管方面的活性。大量的研究發(fā)現(xiàn)，許多天然或合成的苯并呋喃類木脂素都具有顯著的抗腫瘤活性，且抗腫瘤活性與干擾細(xì)胞內(nèi)微管蛋白的聚合與解聚活性有關(guān)。 微管(microtubule)是存在于所有真核細(xì)胞中，由微管蛋白(tubulin)裝配、聚合而成的長(zhǎng)管狀細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，能與其它蛋白共同組裝成纖毛、鞭毛、軸突、神經(jīng)管、基粒、中心粒、紡錘體等結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞骨架的構(gòu)成、細(xì)胞形態(tài)的維持、

5、細(xì)胞收縮、偽足運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸以及細(xì)胞分裂等。在GTP、Mg<'2+>及微管相關(guān)蛋白(MAP)等存在時(shí)，微管依賴于微管蛋白二聚體對(duì)其不停地結(jié)合與分離而處于一種裝配與去裝配的動(dòng)態(tài)平衡中，即聚合一解聚的動(dòng)態(tài)平衡。在有絲分裂過(guò)程中，當(dāng)細(xì)胞由分裂間期進(jìn)入有絲分裂前期后，細(xì)胞質(zhì)中的微管迅速解聚并重組為紡錘體，紡錘體微管附著于染色單體的著絲粒，參與染色單體的分離。分裂進(jìn)入末期后，紡錘體又解聚裝配成微管。由此可見(jiàn)，為行使正常的微管功能，微管處于動(dòng)

6、態(tài)的裝配和解聚狀態(tài)是非常重要的。 微管與紡錘體之間的互變是細(xì)胞分裂的重要環(huán)節(jié)?？刮⒐芑衔锞芨蓴_這一環(huán)節(jié)，影響微管的正常功能，引起有絲分裂阻滯，并通過(guò)一系列的信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。與正常細(xì)胞相比較，分裂增殖旺盛的腫瘤細(xì)胞對(duì)這種干擾作用更加敏感。因此，作用于微管，干擾細(xì)胞有絲分裂的化合物，都有可能開(kāi)發(fā)成為抗腫瘤藥物。能夠干擾微管功能的苯并呋喃類木脂素因而具有良好的開(kāi)發(fā)前景，值得深入研究。中山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院綜合分析了大量天然苯并

7、呋喃木脂素的結(jié)構(gòu)與活性，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)合成了一系列帶有不同取代基的2-芳基苯并呋喃類木脂素，擬對(duì)其抗腫瘤活性及構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行研究，期望篩選出具有良好活性的化合物。本研究共篩選了14個(gè)苯并呋喃化合物，發(fā)現(xiàn)化合物：ERJT-12具有明顯的體外抗增殖作用及抗微管作用，并探討了其作用的分子機(jī)制。 方法與結(jié)果：1．2-芳基苯并呋喃類木脂素化合物的體外抗增殖活性 方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞接種于96孔板，每種化合物均設(shè)不同濃度的用藥

8、組及相應(yīng)的溶劑對(duì)照組。MTT法檢測(cè)每孔OD值，Bliss法計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC<,50>值)。 結(jié)果：在所篩選的14種化合物中，化合物ERJT-12的細(xì)胞毒作用最強(qiáng)；ERJT-18和ERJT-30的細(xì)胞毒性較ERJT-12稍弱；ERJT-06、ERJT-16、ERJT-26、ERJT-28呈現(xiàn)輕度的細(xì)胞毒作用；化合物ERJT-09、ERJT-21、ERJT-23、ERJT-29的細(xì)胞毒作用不明顯?；衔颬JY-02、PJY-0

9、4和ERJT-01溶解度較差，對(duì)上述3種腫瘤細(xì)胞的．IC<'5o>值未能檢測(cè)。 進(jìn)一步檢測(cè)化合物ERJT-12對(duì)多種人腫瘤細(xì)胞的體外抗增殖作用。結(jié)果顯示：人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人口腔上皮癌細(xì)胞KB-3-1對(duì)化合物ERJT-12比較敏感，IC<,50>值分別為5.75±O.38uM、6.75±O.68μM；人肺腺癌細(xì)胞GLC82和人膀胱癌細(xì)胞ECV-304對(duì)ERJT-12的敏感性較低，IC<,50>值分別為15.18±1.56

10、μM、17.29±1.64μM。 化合物ERJT-12對(duì)多藥抗藥細(xì)胞也具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用。對(duì)KB一3-1細(xì)胞(敏感株)的IC<,5o>值為6.75±0.68 uM，對(duì)C-A120細(xì)胞(阿霉素275倍耐藥株)的IC<,50>值為8.87±O.66μM，耐藥倍數(shù)為1.3倍；ERJ-12對(duì)CCRF-CEM細(xì)胞(敏感株)的．IC<,50>值為8.82±0.37μM，對(duì)CCRF—VCRl000細(xì)胞(長(zhǎng)春新堿8123倍耐藥株)的IC<,

11、50>值為13.75±1.69μM，耐藥倍數(shù)為1.6倍。 2．ERJT-12對(duì)MCF-7細(xì)胞周期及相關(guān)的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的影響 2．1．流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布 方法：收集不同濃度ERJT-12處理的MCF-7細(xì)胞，PBS洗滌，70％乙醇固定。離心懸浮細(xì)胞于PBS，溴化丙啶(PI)染色后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA含量，LYSIS軟件分析。 結(jié)果：不同劑量ERJT-12分別作用MCF-7細(xì)胞24h后，細(xì)胞出現(xiàn)

12、不同程度的G<,2>/M期阻滯，呈劑量依賴性。同時(shí)，各處理組G<,1>期細(xì)胞所占比例呈劑量依賴性下降，S期細(xì)胞比例無(wú)明顯改變。 2.2.Western blot法檢測(cè)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)情況 方法：不同濃度的ERJT-12處理MCF-7細(xì)胞24h后制備蛋白樣品，定量。每泳道加等量樣品后開(kāi)始聚丙烯酰胺凝膠電泳，按常規(guī)轉(zhuǎn)印及封閉，分別標(biāo)記一抗、二抗，暗室中曝光、沖片。 結(jié)果：不同劑量ERJT-12分別處理MCF-7

13、細(xì)胞24h后，Cdc25c總蛋白的表達(dá)無(wú)明顯改變，而Ser-216(216位絲氨酸)磷酸化的Cdc25c的表達(dá)則呈劑量依賴性上調(diào)，即失活狀態(tài)的Cdc25c增多；相同作用條件下，CDKl總蛋白的表達(dá)無(wú)明顯改變，而Thrl4/Tlyrl5(14位蘇氨酸/15位酪氨酸)磷酸化的CDKl表達(dá)則呈上調(diào)趨勢(shì)，即未被激活的CDKl增加；CyclinBl蛋白的表達(dá)隨處理劑量的增加而下調(diào)。 3．ERJT-12誘導(dǎo)有絲分裂阻滯及對(duì)微管蛋白聚合的影響

14、 3.1.Giemsa染色觀察有絲分裂阻滯 3.2.比色法檢測(cè)微管蛋白聚合活性 結(jié)果：ERJT-12能夠抑制微管蛋白的聚合，其抑制作用與秋水仙堿類似，且隨劑量增加抑制作用增強(qiáng)。 3.3．細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn) 方法：細(xì)胞經(jīng)固定、透化處理后封閉，依次與抗微管蛋白抗體及相應(yīng)FITC標(biāo)記的二抗孵育一定時(shí)間，熒光顯微鏡下觀察。 結(jié)果：ERJT-12處理組細(xì)胞微管的改變與秋水仙素組類似，微

15、管趨向于解聚，在胞漿中的密度降低。 4．化合物ERJT-12誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡及機(jī)理研究 4.1．流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 4.2．DNA梯形條帶檢測(cè) 4.3．Caspase-3、Caspase-6活性檢測(cè) 4.4．Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中Bcl-2、Bax蛋白的磷酸化狀態(tài)及表達(dá)情況 [結(jié)論] 1.14個(gè)全新合成的苯并呋喃木脂素化合物中，4-位甲?；〈幕衔?E

16、RJT-12細(xì)胞毒作用最明顯，對(duì)體外培養(yǎng)的多種人腫瘤細(xì)胞均有不同程度的生長(zhǎng)抑制作用，對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抗增殖作用最顯著；ERJT-12對(duì)多藥抗藥的人口腔上皮癌細(xì)胞C-A120和淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞CCRF-VCRl000有較明顯的細(xì)胞毒作用，與抗癌藥物ADM、VCR和VP-16之間沒(méi)有明顯的 交叉抗藥性。 2．ERJT-12能夠誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞出現(xiàn)明顯的G<,2>/M期阻滯，呈劑量依賴性。阻滯作用的原因可能是使G<,2>

17、/M期調(diào)控蛋白Cdc25c磷酸化失活，同時(shí)下調(diào)CyclinBl蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致G<,2>/M期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵分子CDKl無(wú)法激活。 3．ERJT-12能夠抑制微管蛋白的聚合，作用類似于秋水仙堿，從而干擾紡錘體的功能，誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞阻滯于有絲分裂期。 4．ERJT-12能以劑量依賴性和時(shí)間依賴性關(guān)系誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。凋亡的誘發(fā)因素可能是G<,2>期和M期的雙重阻滯，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)不可逆的損傷。Caspase家族成員和B