Dlx5基因促進室管膜前下區(qū)神經(jīng)干細胞向酪氨酸羥化酶陽性細胞分化的實驗研究.pdf

1、目的: 體外分離培養(yǎng)出生24h內(nèi)SD乳鼠室管膜前下區(qū)（Anterior subventricularzone，SVZa）神經(jīng)干細胞( Neural stem cells，NSCs)，通過基因轉(zhuǎn)染等方法研究Dlx5（distall-less homeobox5）基因?qū)VZa NSCs向酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase,TH）陽性細胞分化過程中的影響。
　　方法: （1）構(gòu)建一個重組腺病毒穿梭載體質(zhì)粒pDC31

2、6-mCMV-EGFP-mDlx5及對照重組腺病毒包裝；（2）利用細胞培養(yǎng)技術(shù)對SVZa NSCs進行分離培養(yǎng)及傳代，用免疫熒光細胞化學(xué)方法鑒定其干細胞特性及分化潛能；（3）利用基因轉(zhuǎn)染、RT-PCR等方法檢測重組質(zhì)粒在SVZa NSCs中的表達情況；（4）用熒光標(biāo)記方法觀察轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細胞分化后的形態(tài)特點及鑒定分化細胞的類型,以了解與神經(jīng)元分化的關(guān)系；（5）轉(zhuǎn)染Dlx5基因的SVZa NSCs分化后，用多巴胺（DA）能神經(jīng)元特異性標(biāo)記

3、物即酪氨酸羥化酶（TH）免疫組化染色，以了解轉(zhuǎn)染后的NSCs分化成TH陽性細胞的比例。
　　結(jié)果: （1）成功構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pDC316-mCMV-EGFP-mDlx5，插入786bp片段與已知小鼠基因同源性為100％，沒有開放閱讀框的移位；（2）原代培養(yǎng)的SVZa神經(jīng)細胞球nestin免疫熒光表達陽性，分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)其分化后的神經(jīng)細胞NSE、GFAP、CNP免疫熒光均表達陽性；（3）重組腺病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SVZa NSCs后

4、，8h出現(xiàn)少量綠色熒光，16h開始增多，48h到高峰，并能夠穩(wěn)定表達較長時間；RT-PCR檢測到轉(zhuǎn)染24h后的神經(jīng)細胞有外源轉(zhuǎn)染基因的mRNA表達，說明構(gòu)建的重組腺病毒載體質(zhì)?？梢栽赟VZa NSCs中穩(wěn)定表達；（4）基因轉(zhuǎn)染后神經(jīng)細胞按形態(tài)特征分兩類：第1類細胞突起從胞體分別向兩個相反方向伸長，形成兩極，無或少分支；第2類是從胞體一端發(fā)出一條較長的突起，類似神經(jīng)元的軸突，其他突起則細、短。通過NSE免疫熒光證實為神經(jīng)元樣細胞，TH染色

5、證實能夠分化成TH陽性細胞；（5）常規(guī)傳代培養(yǎng)誘導(dǎo)分化后，實驗組和對照組均有TH陽性細胞出現(xiàn)，比率分別為實驗組（34.20±0.14）%,對照組：（11.28±0.81）%，其分化成TH陽性細胞比率比較，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論: 1.體外成功分離、培養(yǎng)并鑒定新生24h內(nèi)SD乳鼠SVZa NSCs；2.成功構(gòu)建重組腺病毒穿梭載體質(zhì)粒（AD-Dlx5）且Dlx5基因能在NSCs中穩(wěn)定表達；3.Dlx5基因與SVZa