家蠶苯丙氨酸羥化酶基因(BmPAH)和色氨酸羥化酶基因(BmTRH)克隆、表達(dá)及功能研究.pdf

1、芳香族氨基酸羥化酶(AAAH)對(duì)芳香族氨基酸代謝具有重要的生理作用。芳香族氨基酸羥化酶家族(AAAHs)包括苯丙氨酸羥化酶(PAH)、色氨酸羥化酶(TRH)和酪氨酸羥化酶(TH)。苯丙氨酸羥化酶(PAH)廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物。苯丙氨酸羥化酶(PAH)是苯丙氨酸代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)變成酪氨酸，是哺乳動(dòng)物體內(nèi)苯丙氨酸正常分解代謝唯一途徑的限速步驟。人類PAH基因與重要代謝疾病苯丙酮尿癥(PKU)密切相關(guān)，線蟲的PAH

2、基因與表皮的黑色素合成有關(guān)，果蠅PAH基因與表皮硬化、眼色素合成以及神經(jīng)活動(dòng)有關(guān)，埃及伊蚊PAH基因與防御免疫黑化有關(guān)，但至今未見關(guān)于鱗翅目昆蟲PAH基因的相關(guān)報(bào)道。家蠶作為鱗翅目昆蟲代表，明確家蠶PAH基因(BmPAH)的作用和功能，對(duì)充分發(fā)揮家蠶的模式作用，在農(nóng)林上建立防治鱗翅目害蟲的新技術(shù)和新途徑具有重要意義，同時(shí)對(duì)人類重要疾病PKU的治療也具有參考價(jià)值。
　　 色氨酸羥化酶(TRH)是5-羥色胺(5-HT)合成的限速酶和

3、關(guān)鍵酶，其活性的高低直接決定著神經(jīng)元內(nèi)5-HT的含量，色氨酸羥化酶(TRH)是確定5-HT能神經(jīng)元的最好標(biāo)志。5-HT廣泛存在于脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)，參與多種行為和發(fā)育調(diào)節(jié)。臨床上，TRH基因的多態(tài)性伴隨多種心理障礙疾病，如抑郁癥、強(qiáng)迫癥、厭食癥、食欲過旺癥、老年前癡呆癥以及精神分裂癥等。昆蟲上，關(guān)于TRH基因的研究報(bào)道很少，僅果蠅中有相關(guān)研究。家蠶作為模式生物，克隆和表達(dá)家蠶TRH基因(BmTRH)對(duì)推進(jìn)識(shí)別昆蟲5-HT能神

4、經(jīng)元的形態(tài)、類型、分布以及各神經(jīng)元之間的聯(lián)系具有重要意義。
　　 基于上述理由，本論文對(duì)家蠶PAH基因(BmPAH)和TRH基因(BmTRH)進(jìn)行了克隆、表達(dá)及功能研究，主要結(jié)果如下：
　　 1、BmPAH基因克隆、序列分析及表達(dá)模式研究
　　 本研究克隆的BmPAH基因cDNA序列長1433bp，其中ORF序列長1371bp。BmPAH基因位于家蠶1號(hào)染色體nscaf2734上，包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，外顯

5、子/內(nèi)含子邊界均符合GT-AG規(guī)則；BmPAH基因編碼456個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白的分子量大小約為52kDa，等電點(diǎn)為5.46。預(yù)測(cè)顯示BmPAH蛋白包含完整的ACT結(jié)構(gòu)域和羥化苯丙氨酸的結(jié)構(gòu)域，無信號(hào)肽序列，屬非分泌蛋白。
　　 BmPAH基因組織表達(dá)分析結(jié)果表明：BmPAH基因轉(zhuǎn)錄本在家蠶5齡3天的精巢、卵巢、頭、體壁和脂肪體中有高量表達(dá)，血液中有表達(dá)但不高，在絲腺、中腸、氣管和馬氏管中表達(dá)量低或不表達(dá)。芯片數(shù)據(jù)和RT-PCR實(shí)

6、驗(yàn)結(jié)果完全一致。
　　 以家蠶個(gè)體總cDNA為模板，RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BmPAH基因轉(zhuǎn)錄本在家蠶胚胎期表達(dá)量依胚胎發(fā)育大小而不同，發(fā)育時(shí)間長的大胚胎比發(fā)育時(shí)間短的小胚胎表達(dá)量高，這與家蠶胚胎后期合成大量黑色素比較一致；BmPAH基因轉(zhuǎn)錄本在家蠶幼蟲各齡的眠蠶起蠶都有表達(dá)，與幼蟲蛻皮合成大量黑色素、表皮重新著色比較一致；BmPAH基因轉(zhuǎn)錄本在家蠶變態(tài)期的表達(dá)量，總體上明顯少于胚胎和幼蟲兩個(gè)階段。
　　 2、BmPA

7、H基因原核表達(dá)、western blotting及免疫組化分析
　　 本研究構(gòu)建了序列和插入方向都正確的BmPAH基因原核表達(dá)載體--BmPAH/pET-28a(+)重組質(zhì)粒。在原核中表達(dá)的蛋白出現(xiàn)于沉淀，經(jīng)質(zhì)譜鑒定的確為BmPAH基因編碼的蛋白。用BmPAH基因原核表達(dá)蛋白免疫家兔獲得的多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡和免疫組化實(shí)驗(yàn)。western blotting實(shí)驗(yàn)顯示，家蠶幼蟲5齡3天的脂肪體、卵巢和精巢3個(gè)組織總蛋白中有BmPA

8、H蛋白的陽性信號(hào)，脂肪體中信號(hào)相對(duì)較強(qiáng)；BmPAH蛋白在脂肪體中大量表達(dá)，與家蠶脂肪體象人類肝臟、是苯丙氨酸代謝的主要場(chǎng)所一致。5齡3天幼蟲組織的免疫組化結(jié)果顯示，在家蠶頭部整個(gè)組織都有BmPAH蛋白的陽性信號(hào)，與家蠶頭部分布有黑色素、著生許多感覺器官一致；在體壁的真皮層和內(nèi)表皮中均檢測(cè)到BmPAH蛋白的陽性信號(hào)，與真皮細(xì)胞和內(nèi)表皮是體壁黑色素等物質(zhì)合成的場(chǎng)所相符；在精巢膜和卵巢膜上BmPAH蛋白信號(hào)較強(qiáng)，精巢膜內(nèi)生精囊等也有目的蛋白信

9、號(hào)，可能與家蠶生殖腺發(fā)育以及生殖細(xì)胞成熟有關(guān)；在中樞神經(jīng)組織中BmPAH蛋白陽性信號(hào)較強(qiáng)，可能與神經(jīng)活動(dòng)有關(guān)。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果完全吻合，但與免疫印跡結(jié)果不一致，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是目標(biāo)蛋白在總蛋白中含量太低以致免疫印跡檢測(cè)不到引起。
　　 3、BmPAH基因在家蠶黑色素合成上的功能研究
　　 無論用自己合成的dsRNA片段還是公司生產(chǎn)的siRNA，注射產(chǎn)下3小時(shí)以內(nèi)的蠶卵，都出現(xiàn)一定數(shù)量的著色淺

10、、著色不均甚至不著色的發(fā)育但不孵化的陽性表型胚胎，熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果均顯示，陽性表型胚胎中的BmPAH基因轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量明顯低于對(duì)照，暗示出現(xiàn)的陽性表型與BmPAH基因被RNA干涉密切相關(guān)。HPLC-FLU分析siRNA注射的蠶卵，結(jié)果siRNA陽性個(gè)體中酪氨酸含量明顯低于siRNA陰性個(gè)體和對(duì)照，且siRNA陽性個(gè)體中的苯丙氨酸有曾積累的痕跡，這與BmPAH基因被干涉，轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量降低，基因產(chǎn)物量減少，催化反應(yīng)活動(dòng)變?nèi)?，形成酪氨酸?/p>

11、產(chǎn)物量降低一致。HPLC-FLU分析結(jié)果與熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果能夠相互印證，相互吻合。一方面說明我們克隆的家蠶BmPAH基因編碼的蛋白具有羥化苯丙氨酸轉(zhuǎn)變成酪氨酸的活力，是名副其實(shí)的PAH基因；另一方面說明BmPAH基因參與了家蠶胚胎期黑色素合成，是家蠶胚胎期黑色素合成的關(guān)鍵基因之一。
　　 用PAH抑制劑注射普斑蠶基礎(chǔ)斑紋的一側(cè)，與另一側(cè)未注射的對(duì)稱斑紋相比，出現(xiàn)注射處斑紋顏色不同程度的變淡或消失的陽性個(gè)體，陽性個(gè)體發(fā)生率隨

12、注射劑量的增加而增加，這說明家蠶幼蟲斑紋黑色素合成與BmPAH活性密切相關(guān)。用PAH抑制劑培養(yǎng)含有半月紋位置的體壁，表皮斑紋處著色很淺或不著色，而用PAH抑制劑和酪氨酸同時(shí)培養(yǎng)體壁，表皮斑紋處有明顯的黑色素合成沉積，這不僅進(jìn)一步說明表皮斑紋黑色素合成與BmPAH活性密切相關(guān)，而且說明BmPAH催化形成的酪氨酸是幼蟲斑紋黑色素合成的主要來源。綜合分析PAH抑制劑注射和培養(yǎng)體壁實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為BmPAH催化苯丙氨酸形成的酪氨酸是家蠶幼蟲斑紋黑

13、色素合成的主要來源，苯丙氨酸是家蠶幼蟲斑紋黑色素合成的重要前驅(qū)物，BmPAH基因參與了家蠶幼蟲斑紋黑色素的合成，是家蠶幼蟲斑紋黑色素合成的關(guān)鍵基因之一。
　　 縱觀家蠶整個(gè)生命周期，胚胎期著色和幼蟲期斑紋重新著色，黑色素類物質(zhì)合成最為旺盛。苯丙氨酸是家蠶必需氨基酸，家蠶體內(nèi)不能自己合成。綜合家蠶這些生理特點(diǎn)和前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析認(rèn)為：BmPAH基因參與了家蠶黑色素合成，是家蠶黑色素合成途徑上的關(guān)鍵基因之一；BmPAH催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)

14、化成酪氨酸是家蠶黑色素合成途徑上的一個(gè)重要反應(yīng)步驟，苯丙氨酸是家蠶黑色素合成最前端、最原始的前驅(qū)物；苯丙氨酸→→→→酪氨酸是家蠶黑色素合成途徑上的第一個(gè)反應(yīng)步驟。
　　 4、BmTRH基因克隆、序列分析及表達(dá)模式研究
　　 本研究克隆的BmTRH基因cDNA序列長1520bp，其中ORF序列長1509bp。BmTRH基因位于家蠶1號(hào)染色體nscaf1690上，包含9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，外顯子/內(nèi)含子邊界均符合GT-AG

15、規(guī)則；BmTRH基因編碼502個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白的分子量大小約為57 kDa，等電點(diǎn)為5.72。預(yù)測(cè)顯示BmTRH蛋白包含一個(gè)ACT結(jié)構(gòu)域和典型的羥化色氨酸的催化結(jié)構(gòu)域，無信號(hào)肽序列，屬非分泌蛋白。
　　 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，在家蠶幼蟲5齡3天11個(gè)組織中，BmTRH基因轉(zhuǎn)錄本僅在頭和中樞神經(jīng)表達(dá)，其中在中樞神經(jīng)的表達(dá)量比頭高。以家蠶個(gè)體總cDNA為模板，RT-PCR檢測(cè)家蠶胚胎、幼蟲及變態(tài)4個(gè)發(fā)育階段39個(gè)時(shí)間點(diǎn)，僅有一

16、個(gè)時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)了擴(kuò)增帶。
　　 5、BmTRH基因原核表達(dá)、western blotting及免疫組化分析
　　 本研究構(gòu)建了序列和插入方向都正確的BmTRH基因原核表達(dá)載體--BmTRH/pET-28a(+)重組質(zhì)粒。在原核中表達(dá)的蛋白出現(xiàn)于沉淀，經(jīng)質(zhì)譜鑒定確實(shí)為BmTRH基因編碼的蛋白。用BmTRH基因原核表達(dá)蛋白免疫家兔獲得的多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡和免疫組化實(shí)驗(yàn)。western blotting結(jié)果顯示，家蠶5齡3天

17、幼蟲9個(gè)組織總蛋白中沒有出現(xiàn)BmTRH蛋白的陽性信號(hào)；家蠶5齡3天幼蟲組織免疫組化顯示，在頭部有BmTRH蛋白的陽性信號(hào)，在中樞神經(jīng)組織中目的蛋白的信號(hào)較強(qiáng)，在體壁、精巢、卵巢等組織沒有檢測(cè)到目的蛋白的陽性信號(hào)。免疫組化結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致，但與免疫印跡的結(jié)果不一致，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于目標(biāo)蛋白在總蛋白中的含量太低以致免疫印跡檢測(cè)不到所致。BmTRH基因僅在家蠶神經(jīng)活動(dòng)非常豐富的頭部組織，和專一進(jìn)行神經(jīng)活動(dòng)的中樞神經(jīng)組織表