環(huán)孢菌素A對STZ誘導的糖尿病大鼠腎臟自身免疫和炎癥損傷的預防作用探討.pdf

1、第一部分環(huán)孢菌素A對STZ誘導的糖尿病大鼠腎臟病變的預防作用目的：糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，是導致終末期腎功能衰竭的主要原因。目前DN的治療原則是控制血糖、控制血壓、飲食控制和保護腎功能。仍然有一部分DM患者發(fā)生DN，一旦進入臨床蛋白尿期，盡管基于各種干預手段，DN患者的腎功能還是會減退，約有20％發(fā)展至終末期腎病，需長期堅持透析治療或腎移植。最新病理發(fā)現(xiàn)淋巴細胞和巨噬細胞在腎臟組織的浸潤是DN受到細胞免疫損傷的

2、新證據(jù)。除此以外，炎癥機制參與了DN的發(fā)展過程。證據(jù)之一是本試驗細胞因子例如MCP-1、RANTES和NF-KB的分子機制研究。本試驗旨在觀察免疫抑制劑環(huán)孢菌素A(CsA)對DM大鼠腎臟病變是否具有預防作用。方法：雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠按50mg/kg體重尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導糖尿病模型。所選動物遵循體重分層隨機原則分為正常對照組(NN組)，糖尿病組(AMN組)，胰島素干預組(AMI組)，STZ誘導糖尿

3、病模型前一周開始CsA1mg/kg/d干預組(BML組)，STZ誘導糖尿病模型前一周開始CsA4mg/kg/d干預組(BMM組)STZ誘導糖尿病模型前一周開始CsA8mg/kg/d干預組(BMH組)，CsA1mg/kg/d干預組(AML組)，CsA4mg/kg/d干預組(AMM組)，CsA8mg/kg/d干預組(AMH組)，CsA1mg/kg/d干預正常對照組(NL組)，CsA4mg/kg/d干預正常對照組(NM組)，CsA8mg/kg

4、/d干預正常對照組(NH組)。DM大鼠誘導成功8周后，用生化方法檢測血糖、尿素氮、肌酐水平；免疫比濁法測定尿微量白蛋白。石蠟切片光學顯微鏡下觀察大鼠腎臟的組織病理學改變。透射電鏡觀察大鼠腎臟組織的超微結構變化。Image-proplus多功能真彩色生物圖象分析系統(tǒng)分析腎臟組織的纖維化改變。結果：AMN組出現(xiàn)明顯腎臟組織的纖維化，系膜區(qū)明顯增寬，基膜增后，近曲小管上皮細胞凋亡明顯。腎重/體重增加，尿素氮、肌酐、尿微量白蛋白顯著增加(P＜0

5、.05)。AMI組腎重/體重，肌酐、尿微量白蛋白與AMN無明顯改善(P＞0.05)，腎臟組織的纖維化、尿素氮水平降低(P＜0.05)，超微結果無明顯改善。CsA各干預組腎臟組織的纖維化明顯減輕(P＜0.05)，尿素氮、尿微量白蛋白顯著減少(P＜0.05)，腎重/體重、肌酐有所降低，但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。CsA各干預組與AMI組相比腎臟組織的纖維化進一步明顯減輕(P＜0.05)，尿微量白蛋白顯著減少(P＜0.05)，低劑量組腎臟

6、超微結果無明顯改善，中高劑量組腎臟超微結果無損傷。CsA干預各對照組腎臟組織的纖維化程度、腎重/體重、尿素氮、肌酐、尿微量白蛋白無明顯變化。結論：1.STZ誘導的糖尿病大鼠自然病程8周可出現(xiàn)明顯的腎臟免疫損害。2.胰島素治療能在一定程度上減緩腎臟纖維化，但CsA腎保護作用即預防腎纖維化作用比胰島素治療更好。3.CsA干預對STZ誘導的糖尿病大鼠腎臟的損害有明顯的保護作用。4.CsA在實驗過程中大鼠未出現(xiàn)對大鼠腎功能的明顯的損害。

7、 第二部分環(huán)孢菌素A預防STZ誘導的糖尿病大鼠腎臟病變的免疫學機制目的：目前觀點認為糖尿病腎病是一種非免疫性腎病，但有越來越多的證據(jù)和試驗結果表明，免疫細胞參與了糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。淋巴細胞和巨噬細胞的浸潤可導致非免疫性腎病腎臟固有細胞的纖維化。本試驗旨在了解應用CsA干預對STZ誘導的DM大鼠腎臟病變免疫機制的影響。方法：雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠按50mg/kg體重尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導糖尿病模型。

8、所選動物遵循體重分層隨機原則分為正常對照組(NN組)，糖尿病組(AMN組)，胰島素干預組(AMI組)，STZ誘導糖尿病模型前一周開始CsA1mg/kg/d干預組(BML組)，STZ誘導糖尿病模型前一周開始CsA4mg/kg/d干預組(BMM組)STZ誘導糖尿病模型前一周開始CsA8mg/kg/d干預組(BMH組)，CsA1mg/kg/d干預組(AML組)，CsA4mg/kg/d干預組(AMM組)，CsA8mg/kg/d干預組(AMH組)

9、。流式細胞術檢測外周血T淋巴細胞亞群分類，ELLISA法檢測免疫球蛋白的血清濃度，免疫組化法檢測CD3+T淋巴細胞在腎臟組織的浸潤和免疫球蛋白在腎臟組織的沉積，冰凍切片免疫熒光染色技術觀察腎臟組織免疫球蛋白的局部表達。結果：AMN組外周血CD3+T細胞計數(shù)明顯降低，CD4+/CD8+比值明顯降低(P＜0.01)。腎臟組織CD3+細胞浸潤明顯增多，IgA、IgG沉積明顯增強(P＜0.01)。AMI組外周血CD3+T細胞計數(shù)、CD4+/CD

10、8+比值、腎臟組織CD3+細胞浸潤和IgA、IgG沉積與糖尿病大鼠相比無明顯變化(P＞0.05)。CsA各干預組比AMN組外周血CD4+/CD8+比值明顯升高(P＜0.01)。腎臟組織CD3+細胞浸潤明顯減少，IgA、IgG沉積明顯減弱(P＜0.01)。外周血CD3+T細胞計數(shù)不同程度降低，BML和BMH組下降明顯(P＜0.05)。結論：1.STZ誘導的DM大鼠存在免疫功能紊亂，自身免疫功能紊亂如腎臟淋巴細胞浸潤和免疫球蛋白沉積，可能是

11、DN的重要發(fā)病機制之一。2.胰島素治療對于STZ誘導的DM大鼠的免疫功能無明顯影響。3.CsA對STZ誘導的DM大鼠腎臟保護作用可能是通過對大鼠免疫干預作用實現(xiàn)的。 第三部分環(huán)孢菌素A預防STZ誘導的糖尿病大鼠腎臟病變的炎癥機制目的：本試驗旨在觀察CsA干預對NF-KB為中心環(huán)節(jié)、下游C-C類趨化因子參與的炎癥機制的調節(jié)作用，CsA對DN預防作用的炎性機制探討。方法：通過免疫組化法檢測核因子NF-KBP65在腎臟組織的蛋白表達和

12、激活；通過半定量逆轉錄多聚酶鏈式反應(reversetranscript-polymerasechainreaction,RT-PCR)、westernblot技術、免疫組化法，檢測C-C類趨化因子MCP-1和RANTES在DM大鼠腎臟組織的mRNA水平和蛋白水平的表達。結果：AMN組大鼠腎臟組織NF-KB表達明顯增加，活化增強(P＜0.01)；MCP-1和RANTES在mRNA水平和蛋白水平高表達(P＜0.01)。AMI組大鼠腎臟組織

13、NF-KB表達減少，活化減弱(P＜0.05)，MCP-1和RANTES在mRNA水平和蛋白水平高表達，與AMN組無差異(P＞0.05)。CsA各干預組腎臟組織NF-KB表達明顯減低，活化減弱(P＜0.01)；MCP-1和RANTES在mRNA水平和蛋白水平低表達(P＜0.01)。CsA各干預組比AMI組NF-KB在腎臟組織表達進一步減低，活化減弱(P＜0.01)。結論：1.DM大鼠腎臟組織中過度活化的NF-KB，高表達的趨化因子MCP-