人工蟲草對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠肝臟保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:不少研究顯示糖尿病患者不同臟器和組織存在淋巴細(xì)胞侵潤和免疫復(fù)合物的沉積，提示糖尿病慢性并發(fā)癥的形成有多種免疫異常機(jī)制參與。糖尿病肝臟疾病(diabeticliverdisease，DLD)是糖尿病(diabetesmellitus，DM)的慢性并發(fā)癥之一，其肝臟病變也可能存在免疫異常和免疫損傷。目前研究多認(rèn)為慢性低度炎癥是DLD的主要發(fā)病機(jī)制之一。DLD早期表現(xiàn)為谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高，隨之肝細(xì)胞出現(xiàn)脂質(zhì)變性，壞死，肝Kuffer細(xì)胞和肝

2、星狀細(xì)胞活化，細(xì)胞外基質(zhì)異常分泌時(shí)，最終導(dǎo)致肝纖維化。單核細(xì)胞趨化因子-1(monocytechemoattractantprotein-1，MCP-1)是一種強(qiáng)效趨化因子，可使各種炎性細(xì)胞尤其是單核細(xì)胞向病變部位聚集，現(xiàn)有研究認(rèn)為MCP-1的過度趨化單核細(xì)胞聚集從而引起肝內(nèi)炎癥的發(fā)生，可能在糖尿病性肝臟疾病中起著重要的作用。TNF-α是一種單核因子，主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，中性粒細(xì)胞、肝Kuffer細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞亦可

3、產(chǎn)生TNF-α，Kuffer細(xì)胞是肝臟局部TNF-α的主要來源。TNF-α具有復(fù)雜的生物學(xué)活性，包括抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和誘發(fā)炎癥反應(yīng)等，其在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中占有重要地位。IL-6是由單核巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞分泌，并具有某些非特異性免疫調(diào)節(jié)作用和在炎癥反應(yīng)中起重要作用的細(xì)胞因子，其在肝臟的生理和病理過程中的作用已引起廣大學(xué)者的關(guān)注。活化的肝星狀細(xì)胞和肝成纖維細(xì)胞是肝臟IL-6的主要來源，IL-6和TNF-α與肝壞死及肝纖維化程度

4、密切相關(guān)，在肝硬化的發(fā)生發(fā)展中參與肝臟的損傷-修復(fù)循環(huán)，最終引起肝臟大量細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積，從而導(dǎo)致肝臟纖維化。吡格列酮（Pglitazone，P）是噻唑烷二酮類藥物，其可以通過調(diào)節(jié)糖脂代謝、改善胰島素抵抗、改善炎癥等途徑發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。冬蟲夏草(Cordycepssinensis(Berk.)Sacc，）為麥角菌科真菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體，既往不少研究顯示冬蟲夏草有免疫調(diào)節(jié)作用，補(bǔ)腎益肺之功效，但對糖

5、尿病肝臟病變研究并不多，有研究認(rèn)為冬蟲夏草對糖尿病肝臟病變有一定的保護(hù)作用，但具體機(jī)制尚不明確。本研究通過一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)的方法，建立1型糖尿病大鼠模型，并應(yīng)用人工發(fā)酵蟲草菌絲體干粉，即人工蟲草(CS，經(jīng)人工發(fā)酵培養(yǎng)獲得發(fā)酵蟲草菌絲體，化學(xué)組成、藥理作用與天然的冬蟲夏草基本一致）和吡格列酮進(jìn)行干預(yù)，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟組織中MCP-1、TNF-α、IL-6表達(dá)變化情況，探討MCP-1、TNF

6、-α、IL-6在糖尿病肝臟損傷發(fā)生發(fā)展中的潛在聯(lián)系，以及CS的肝臟保護(hù)作用機(jī)制及量效關(guān)系。
　　 方法:從90只雄性8周齡SD大鼠中隨機(jī)抽取10只作為正常對照組（N組），其余作為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組大鼠一次性尾靜脈注射大劑量STZ（45mg/kg）。所有成模大鼠根據(jù)血糖水平分層后，隨機(jī)分為糖尿病組（D組），CS小劑量組(L組，0.6g/kg.d)，CS中劑量組(M組，2.5g/kg.d)，CS大劑量組(H組，5g/kg.d)和吡咯列酮

7、組(P組，4mg/kg.d)。成模8周處死。留取血標(biāo)本分別檢測肝功能、血脂。光鏡下觀察各組大鼠肝臟病理組織學(xué)改變，通過免疫組化觀察炎癥反應(yīng)標(biāo)志物MCP-1、TNF-α、IL-6表達(dá)水平的變化，RT-PCR檢測肝組織中MCP-1、TNF-α、IL-6的表達(dá)。
　　 結(jié)果:1.HE染色:正常組大鼠HE染色顯示肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索排列整齊，肝竇正常連接成網(wǎng)狀，無炎癥細(xì)胞浸潤。D組大鼠肝臟顯示肝細(xì)胞邊界不清，肝細(xì)胞內(nèi)

8、出現(xiàn)大量大小不一脂肪空泡即肝細(xì)胞脂肪變性，并可見大量炎性細(xì)胞侵潤，肝小葉結(jié)構(gòu)模糊不清，肝細(xì)胞索排列紊亂，部分肝臟可見肝竇擴(kuò)張。P組和各CS干預(yù)組與D組比較，肝細(xì)胞形態(tài)尚正常，肝小葉結(jié)構(gòu)和肝細(xì)胞索排列有不同程度恢復(fù)，有少量脂肪變性，肝實(shí)質(zhì)點(diǎn)狀和灶狀炎細(xì)胞侵潤。2.Masson染色:正常組大鼠Masson染色僅見血管周圍輕微的藍(lán)綠色膠原著色，肝臟實(shí)質(zhì)未見著色。糖尿病未干預(yù)組大鼠肝臟實(shí)質(zhì)內(nèi)可見大量的膠原沉積，呈彌漫性分布，血管膠原沉積增厚;P

9、和各CS干預(yù)組肝臟病變均明顯輕于D組，肝臟病纖維化程度明顯改善，呈小灶狀、點(diǎn)狀改變。3.D組大鼠肝臟MCP-1表達(dá)較N組明顯增加，與D組比較P組和各CS干預(yù)組大鼠肝臟MCP-1表達(dá)水平均有不同程度降低，其中H組和P組結(jié)果類似，明顯優(yōu)于L、M組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。4.D組大鼠肝臟TNF-α表達(dá)較N組明顯增加，與D組比較P組和各CS治療組大鼠肝臟TNF-α表達(dá)水平均有不同程度降低，其中H組和P組結(jié)果類似，明顯優(yōu)于L、M組，差

10、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。5.D組大鼠肝臟IL-6表達(dá)水平較N組明顯增加，與D組比較P組和各CS治療組大鼠肝臟IL-6表達(dá)水平均有不同程度降低，其中H組和P組結(jié)果類似，明顯優(yōu)于L、M組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:1.STZ誘導(dǎo)建立的DM大鼠模型，可出現(xiàn)明顯的肝功能異常和肝臟病理學(xué)改變。HE染色可見肝細(xì)胞脂質(zhì)變性，大量炎性細(xì)胞侵潤，部分肝臟可見肝竇擴(kuò)張;Masson染色可見肝臟實(shí)質(zhì)內(nèi)有大量的膠原沉積，呈