魚類細(xì)胞中藥物代謝酶體外誘導(dǎo)的研究.pdf

1、本論文的研究內(nèi)容分為三個(gè)部分，第一部分是魚類細(xì)胞藥物代謝研究基礎(chǔ)參數(shù)的確立；第二部分是魚類細(xì)胞中藥物代謝酶活性的誘導(dǎo)研究：第三部分是魚類細(xì)胞中藥物代謝酶表達(dá)的誘導(dǎo)研究。每部分各有兩章，共六章，分別如下：1.魚類細(xì)胞藥物代謝能力基本指標(biāo)的檢測：細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察表明SMMC7721細(xì)胞生長最為迅速，魚類細(xì)胞生長速度相對較慢。利用Lowry比色法測定每107個(gè)細(xì)胞的總蛋白與微粒體蛋白含量。利用差示光譜法檢測細(xì)胞中細(xì)胞色素P450和b5含量，結(jié)果

2、表明，PCP、PSF、GCB、EPC、FHM、CO等細(xì)胞中細(xì)胞色素P450和b5含量極低，其他細(xì)胞P450和b5含量的大小順序均為：SMMC7721＞GCL＞CIK＞PCK，實(shí)驗(yàn)初步認(rèn)為SMMC7721、GCL、CIK、PCK具有較強(qiáng)代謝潛能。將細(xì)胞與相應(yīng)組織所提取的細(xì)胞色素P450的含量進(jìn)行比較，兩者之間有一定的相關(guān)性，回歸方程為Y=1.8298X+0.0198(R2=0.8827)。結(jié)果表明，體外培養(yǎng)細(xì)胞保留了體內(nèi)細(xì)胞一定含量的P4

3、50，這為相應(yīng)的藥物代謝酶的潛在活性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。 2.魚類細(xì)胞的生長特性及藥物敏感性的研究：根據(jù)分別掃描的MTT、FMZ和酚紅的吸收光譜，選取492nm作為FMZ的檢測波長。在0.156×104～10×104cells/well間MTT檢測的細(xì)胞數(shù)與OD值表現(xiàn)出顯著的線性正相關(guān)，可見MTT檢測的OD值能較好地反映活細(xì)胞密度。MTT的作用濃度及反應(yīng)時(shí)間對OD值均有較大影響，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在細(xì)胞MTT檢測中，采用0.5mg/ml為

4、MTT作用濃度，4h為反應(yīng)時(shí)間。細(xì)胞接種量對細(xì)胞的生長速度有一定影響，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果后續(xù)研究中SMMC7721細(xì)胞選擇2.5×104cells/ml，魚類細(xì)胞統(tǒng)一選取105cells/ml為最初接種密度。以MTT檢測法繪制細(xì)胞生長曲線，結(jié)果表明細(xì)胞在第0～1天處于潛伏期，在第1～4天處于對數(shù)生長期，第4天進(jìn)入平臺期，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果后續(xù)研究中細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)1d，藥物對細(xì)胞的作用時(shí)間不超過3d，少于3d則延長預(yù)培養(yǎng)時(shí)間。群體倍增時(shí)間和群體倍增水平的

5、計(jì)算結(jié)果表明不同細(xì)胞增殖能力的大小順序是SMMC7721＞PCK＞GCL＞CIK。以MTT法檢測，Hill模型擬合，獲得各種實(shí)驗(yàn)藥物對不同細(xì)胞的半致死濃度IC50，IC50越小，細(xì)胞對該藥越敏感。 3.魚類細(xì)胞EROD活性的誘導(dǎo)研究：利用分子熒光分析法建立了測定EROD活性的方法，并研究了EROD催化底物反應(yīng)時(shí)間。在此基礎(chǔ)之上分別以Log-Normal、Gentox和Logistic模型擬合并分析比較了誘導(dǎo)劑TCDD、PCB、P

6、B、BaP、3-MC、BNF對GCL細(xì)胞EROD酶活的劑量-效應(yīng)曲線，結(jié)果表明Log-Normal模型能較好的擬合藥酶誘導(dǎo)前升后降的鐘形效應(yīng)曲線，所得方程參數(shù)值p100和EC100可用于藥物代謝酶的誘導(dǎo)研究；Gentox模型擬合度相對較低而且所得EC50參數(shù)值非生物學(xué)半效應(yīng)濃度；而Logistic模型只能擬合曲線誘導(dǎo)上升部分而且EC50和p100與Log-Normal模型相比顯著偏高。進(jìn)一步研究誘導(dǎo)劑作用時(shí)間對劑量效應(yīng)的影響，結(jié)果顯示誘

7、導(dǎo)劑TCDD對GCL細(xì)胞作用時(shí)間越長，EC100越大，p100越小，但在作用48h后即達(dá)到較大誘導(dǎo)效應(yīng)，延長時(shí)間無顯著增強(qiáng)。以TCDD研究不同細(xì)胞對誘導(dǎo)劑的敏感度和誘導(dǎo)潛力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GCL和CIK細(xì)胞中誘導(dǎo)劑的EC100顯著低于PCK和SMMC7721細(xì)胞，而誘導(dǎo)倍數(shù)則是GCL和SMMC7721細(xì)胞顯著高于CIK和PCK細(xì)胞。比較分析PAHs對細(xì)胞EROD誘導(dǎo)與活力抑制的關(guān)系，結(jié)果表明兩者之間有較好的相關(guān)性，而且藥物通過EROD誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)

8、可以在極低濃度下顯示對細(xì)胞生長的潛在毒性。 4.魚類細(xì)胞恩諾沙星脫乙基酶活性的誘導(dǎo)研究：通過RP-HPLC法建立了細(xì)胞中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的檢測方法，方法回收率分別為98.10％±2.98％和94.61％±0.89％，日內(nèi)變異系數(shù)分別為3.19％±1.17％和5.01％±1.86％，日間變異系數(shù)分別為3.63％±1.35％和5.59％±1.88％。在此基礎(chǔ)上對恩諾沙星在細(xì)胞中的體外代謝進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示藥物RIF和PB的濃度分

9、別在12.6μM和34.8μM時(shí)對ENR脫乙基酶具有最大的誘導(dǎo)倍數(shù)，分別為6.0和2.3；而ERM對ENR脫乙基酶具有抑制作用，EC50為20.3μM。RIF誘導(dǎo)組和對照組細(xì)胞中恩諾沙星代謝的藥時(shí)曲線方程分別為Ct/Co=-0.0654Ln(t)+0.7342和Ct/Co=-0.0280Ln(t)+0.9300，半衰期(t1/2)分別為35.9h和4，672，210h，反應(yīng)12h后ENR消除率分別為41.2％±3.4％和15.3％±4.

10、2％，CIP轉(zhuǎn)化率分別為78.9％±8.7％和51.8％±4.2％，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RIF對ENR的脫乙基代謝具有顯著的促進(jìn)作用。根據(jù)Linewaver-Burk方程，RIF誘導(dǎo)組和對照組的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程分別為1/V=72.5530×1/[S]+1.4922和1/V=530.9800×1/[S]+3.5274。酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)表明，誘導(dǎo)組中的最大反應(yīng)速率Vmax和內(nèi)在清除率Clint均明顯大于對照組，表明RIF誘導(dǎo)的酶催化效能較高。此外對照

11、組米氏常數(shù)Km值是誘導(dǎo)組的17.3倍，表明RIF誘導(dǎo)的酶與底物的親合力較高，酶促反應(yīng)的強(qiáng)度較大。 5.草魚CYP1A和ACT基因cDNA片斷的克隆與鑒定：以Trizol法分別提取BNF誘導(dǎo)和對照處理草魚的肝組織總RNA并合成cDNA第一鏈，以此為模板利用1對ACT特異性引物和8條6對CYP1A簡并引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果引物FO-RO在對照和誘導(dǎo)草魚中均擴(kuò)增得到預(yù)期ACTcDNA片斷，而引物F4-R4在誘導(dǎo)草魚中獲得預(yù)期CYP1AcD

12、NA產(chǎn)物。這兩個(gè)cDNA片斷分別進(jìn)行克隆、測序和比對，BLAST結(jié)果表明草魚ACTcDNA片斷(800bp)與Genbank中已有序列(登錄號M25013)同源性為99.1％，而推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為99.2％；草魚CYP1AcDNA片斷(439bp)與鯉魚同源性最高，為92.5％，而推導(dǎo)的氨基酸同源性為96.6％。通過GenBank提交這兩個(gè)cDNA序列，獲得的登錄號分別為DQ211096和DQ211095。通過Mega3.1軟件的

13、Neighbor-joining程序?qū)YP基因的部分cDNA序列(439bp)和氨基酸序列(145AA)進(jìn)行比對分析并繪制進(jìn)化樹，根據(jù)CYP1A部分蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，在進(jìn)化上可以將參與比對的真骨魚劃分為四個(gè)主要的分支。分析結(jié)果還發(fā)現(xiàn)CYP1A蛋白的兩個(gè)保守區(qū)域所含的半胱氨酸可能對CYP1A蛋白結(jié)構(gòu)的折疊具有特殊意義。 6.草魚細(xì)胞CYP1A基因表達(dá)的誘導(dǎo)研究：在半定量PCR反應(yīng)參數(shù)研究中，對關(guān)鍵的退火溫度和循環(huán)次數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化

14、，結(jié)果顯示退火溫度為57C，循環(huán)次數(shù)為30次較為合適，該條件下Gauss跡量的CYP1A/ACT比值能更準(zhǔn)確的反映CYP1A基因的表達(dá)水平。對照組和誘導(dǎo)組草魚細(xì)胞中ACT和CYP1A基因cDNA擴(kuò)增結(jié)果表明，細(xì)胞中CYP1A基因的基礎(chǔ)表達(dá)量較低，而BNF誘導(dǎo)使GCL、CIK和CO細(xì)胞中CYP1A的表達(dá)水平得到顯著的提高。GCL、CIK和CO細(xì)胞三者之間誘導(dǎo)后CYP1A的表達(dá)水平有顯著差異(P＜0.05)，誘導(dǎo)表達(dá)量大小順序?yàn)镚CL＞CI

15、K＞CO。草魚細(xì)胞系的相應(yīng)組織中ACT和CYP1AcDNA擴(kuò)增以及電泳的結(jié)果與細(xì)胞中較為相似，組織中CYP1A誘導(dǎo)表達(dá)量大小順序也與相應(yīng)的細(xì)胞相同：肝＞腎＞卵巢。比較分析的結(jié)果表明，CYP1A基因在體內(nèi)與體外的誘導(dǎo)表達(dá)水平具有一定的相關(guān)性。在不同細(xì)胞中BNF誘導(dǎo)均導(dǎo)致P450含量、EROD酶活和CYP1AmRNA相對含量在不同程度上得到提高，這表明誘導(dǎo)劑可能通過刺激CYP1A的表達(dá)，增加細(xì)胞中CYP1A的蛋白含量，從而在轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后水