銀杏萜內(nèi)酯的體外代謝及其藥物相互作用.pdf

1、銀杏(Ginkgobiboba)，原產(chǎn)于中國(guó)，是最古老的中生代裸子植物之一，是珍貴的藥用植物。銀杏葉提取物(簡(jiǎn)稱(chēng)EGb)中主要活性成分是銀杏黃酮和銀杏萜內(nèi)酯。銀杏萜內(nèi)酯是一組化合物，主要包括銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯。銀杏內(nèi)酯屬于二萜類(lèi)，主要有銀杏內(nèi)酯A、B、C(簡(jiǎn)稱(chēng)GA、GB、GC)，它們分子中都具有獨(dú)特C20“籠型”結(jié)構(gòu)，由六個(gè)五元環(huán)組成；白果內(nèi)酯屬于倍半萜類(lèi)，由四個(gè)五元環(huán)組成(簡(jiǎn)稱(chēng)BB)。銀杏萜內(nèi)酯是銀杏中特有的化合物，迄今尚未發(fā)現(xiàn)存在于

2、其他任何植物中。銀杏萜內(nèi)酯具有顯著藥理活性：對(duì)肝、胃、腎有保護(hù)作用；能抗脂質(zhì)氧化和清除體內(nèi)自由基；具有抗病毒消炎、抗癌作用等等。大量實(shí)驗(yàn)證明銀杏內(nèi)酯A，B，C是天然PAF拮抗劑，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用，這些藥理作用使它成為在臨床上治療和預(yù)防心腦血管疾病的首選天然藥物。 因?yàn)殂y杏萜內(nèi)酯的特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)和分析上的難度，其分子結(jié)構(gòu)中無(wú)紫外吸收特征基團(tuán)，在紫外200-220nm處僅有很微弱的吸收，所以在現(xiàn)有的文獻(xiàn)中，相對(duì)于

3、銀杏黃酮的研究文獻(xiàn)，有關(guān)銀杏萜內(nèi)酯的研究文獻(xiàn)比較少，尤其是關(guān)于銀杏萜內(nèi)酯的吸收、分布、代謝和排泄等體內(nèi)過(guò)程的報(bào)道更少。為了解銀杏萜內(nèi)酯的體內(nèi)過(guò)程，本文建立了鼠肝微粒體孵育液中銀杏萜內(nèi)酯的含量測(cè)定方法，研究了銀杏萜內(nèi)酯在鼠肝微粒體中的體外代謝情況，考察了銀杏萜內(nèi)酯相互之間的代謝影響。 1.HPLC-ELSD法測(cè)定鼠肝微粒體中銀杏內(nèi)酯及白果內(nèi)酯的方法學(xué)研究目的：建立微粒體中銀杏萜內(nèi)酯的HPLC-ELSD含量測(cè)定方法。方法：以Diam

4、onsilTMODS-C18為色譜柱；甲醇－水(37：63)為流動(dòng)相，流速1.0mL·min-1：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)檢測(cè)：漂移溫度60℃，霧化氣壓力2.5bar，增益值9。鼠肝微粒體孵育液中的銀杏萜內(nèi)酯用乙醚提取，空氣流下?lián)]干乙醚，殘?jiān)眠m量流動(dòng)相溶解，取40μL進(jìn)樣，測(cè)定剩余銀杏內(nèi)酯A，B，C和白果內(nèi)酯的含量。對(duì)鼠肝微粒體孵育液中銀杏內(nèi)酯的HPLC-ELSD法進(jìn)行方法學(xué)研究，并應(yīng)用于銀杏內(nèi)酯的體外代謝研究。結(jié)果：銀杏內(nèi)酯A、

5、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C和白果內(nèi)酯分別在6.80～136.0μg·mL-1，5.40～109.0μg·mL-1，3.6～72.0μg·mL-1和3.30～133.60μg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)γ分別為0.9936，0.9964，0.9959和0.9930(n=5)。測(cè)得定量限分別為3.30μg·mL-1，6.80μg·mL-1，5.40μg·mL-1和3.60μg·mL-1(RSD＜15﹪，n=3)；檢測(cè)限分別為

6、12ng，32ng，20ng和16ng(S/N=3)；方法回收率分別為86.5～98.3﹪，88.6～98.8﹪，85.4～101.8﹪和86.0～102.9﹪(n=5)，日內(nèi)、日間精密度小于10.5﹪。孵育液中其他成分不干擾銀杏內(nèi)酯的測(cè)定。結(jié)論：本法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于銀杏內(nèi)酯的體外代謝研究。 2.銀杏內(nèi)酯A，B，C和白果內(nèi)酯在鼠肝微粒體中的體外代謝目的：獲得銀杏內(nèi)酯A，B，C和白果內(nèi)酯的體外代謝情況，為其臨床合理應(yīng)用和進(jìn)一步開(kāi)

7、發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。方法：對(duì)銀杏內(nèi)酯A，B，C和白果內(nèi)酯在不同誘導(dǎo)劑[β-萘磺酮(BNF)、苯巴比妥(PB)、地塞米松(Dex)和對(duì)照組(未處理)]處理的鼠肝微粒體中的代謝進(jìn)行了研究。將銀杏內(nèi)酯A，B，C和白果內(nèi)酯與各種鼠肝微粒體分別進(jìn)行體外共孵育，用乙醚終止反應(yīng)，HPLC-ELSD測(cè)定孵育后剩余的銀杏內(nèi)酯A，B，C和白果內(nèi)酯的量。結(jié)果：在鼠肝孵育液中反應(yīng)80min后，銀杏內(nèi)酯A，B，C和白果內(nèi)酯的含量在一相代謝中幾乎沒(méi)有變化；在二相葡

8、醛酸結(jié)合反應(yīng)中，銀杏內(nèi)酯A在對(duì)照組、BNF組、PB組、Dex組中的代謝率分別為23.1﹪，24.3﹪，25.6﹪和28.7﹪；銀杏內(nèi)酯B為19.0﹪，21.1﹪，22.0﹪和28.5﹪；銀杏內(nèi)酯C為41.6﹪，46.1﹪，51.5﹪和52.1﹪；白果內(nèi)酯為20.0﹪，30.3﹪，27.1﹪和28.2﹪。測(cè)得銀杏內(nèi)酯A在對(duì)照組、BNF誘導(dǎo)、PB誘導(dǎo)以及Dex誘導(dǎo)的微粒體中的Km和Vmax分別為：14.66±1.85，12.50±1.64，

9、13.60±1.53，48.75±3.26μmol·L-1和7.132±0.735，6.323±0.609，6.064±0.712，9.760±0.814nmol·min-1·mgprotein-1；銀杏內(nèi)酯B的Km和Vmax分別為63.98±6.09，66.44±5.87，42.61±3.24，51.67±5.77μmol·L-1和8.350±0.661，8.685±0.709，9.188±0.659，7.517±0.534nmol·

10、min-1·mgprotein-1：銀杏內(nèi)酯C的Km和Vmax分別為9.56±1.07，26.8±2.54，7.93±1.25，8.17±1.12μmol·L-1和7.261±0.513，7.100±0.488，6.879±0.502，7.591±0.647nmol·min-1·mgprotein-1；白果內(nèi)酯的Km和Vmax分別為38.84±2.99，37.29±3.27，35.76±2.85，32.18±2.88μmol·L-1和7

11、.010±0.498，6.465±0.546，8.516±0.693，9.050±0.701nmol·min-1·mgprotein-1。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一相代謝反應(yīng)中，銀杏內(nèi)酯A，B，C和白果內(nèi)酯在不同處理的鼠肝微粒體中幾乎沒(méi)有發(fā)生代謝作用；但是均有一定程度的二相代謝反應(yīng)，且在不同酶源中的代謝差別不顯著。對(duì)比之下，銀杏內(nèi)酯C的二相代謝能力較其它內(nèi)酯大。 3.銀杏內(nèi)酯A，B，C和白果內(nèi)酯之間的代謝相互作用目的：研究銀杏萜內(nèi)酯

12、各成分在代謝反應(yīng)中的相互影響，以了解銀杏萜內(nèi)酯對(duì)藥酶的作用。方法：銀杏內(nèi)酯A，B，C和白果內(nèi)酯在經(jīng)Dex誘導(dǎo)的鼠肝微粒體中分別兩兩共孵育，以HPLC-ELSD法測(cè)定孵育液中剩余銀杏萜內(nèi)酯的濃度，觀察共孵育藥物在葡醛酸結(jié)合反應(yīng)中的相互影響，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50值和抑制常數(shù)Ki值。結(jié)果：1)銀杏內(nèi)酯A對(duì)銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C和白果內(nèi)酯有一定程度的抑制，IC50值分別為135.0，120.7，345.0μmol·L-1，Ki值分別為11

13、4.4，43.4和159.3μmol·L-1；2)銀杏內(nèi)酯B對(duì)銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯C和白果內(nèi)酯的IC50值分別為67.8，302.0，365.0μmol·L-1，Ki值分別為35.8，197.8和212.8μmol·L-1；3)銀杏內(nèi)酯C對(duì)銀杏內(nèi)酯'A、銀杏內(nèi)酯B和白果內(nèi)酯的IC50值分別為73.3，71.0，157.7μmol·L-1，Ki值分別為30.0，43.8和137.3μmol·L-1；4)白果內(nèi)酯對(duì)銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀