中藥成分對(duì)細(xì)胞色素P450酶介導(dǎo)的藥物代謝體內(nèi)外抑制作用.pdf

1、植物藥長(zhǎng)期用于各種傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，特別是在亞洲各國(guó)應(yīng)用極其廣泛。然而，有關(guān)植物藥的安全性評(píng)價(jià)研究則多有欠缺。而且人們常常把它們當(dāng)做家庭用藥，與處方藥聯(lián)合使用，這就進(jìn)一步造成了用藥安全問(wèn)題。這也使得有關(guān)食品或植物藥引起的相互作用得到了實(shí)質(zhì)性的關(guān)注，并通過(guò)大量的研究來(lái)完善這一特定領(lǐng)域的認(rèn)知。深入了解植物藥-西藥相互作用的作用機(jī)制，對(duì)于評(píng)價(jià)和減少由于藥物聯(lián)合應(yīng)用所引起的臨床風(fēng)險(xiǎn)，特別對(duì)于治療指數(shù)較窄的西藥，有著不可或缺的作用。其中，中藥提取物

2、通過(guò)藥物代謝酶引起相互作用的潛在性研究，有助于臨床醫(yī)師評(píng)估中草藥治療的安全性和有效性。
　　本論文主要由兩部分構(gòu)成:文獻(xiàn)綜述和實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)研究目的主要是通過(guò)對(duì)3種中藥單體成分（延胡索乙素、甲基蓮心堿和小檗堿）對(duì)細(xì)胞色素P450(CYP)酶的體外抑制作用及其機(jī)制的研究，評(píng)價(jià)這3種中藥成分與傳統(tǒng)西藥合用時(shí)產(chǎn)生藥物相互作用的可能性。并且，在體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Cocktail探針?biāo)幬锓?，進(jìn)一步研究其延胡索乙素對(duì)CYP1A2、2D6和3

3、A4酶探針?biāo)幬镌贐eagle犬體內(nèi)代謝的影響，以期探討臨床應(yīng)用時(shí)出現(xiàn)相關(guān)中藥-西藥相互作用的可能性。
　　1.文獻(xiàn)綜述
　　對(duì)本論文的研究背景進(jìn)行了文獻(xiàn)綜述，包括植物藥應(yīng)用及其植物藥-西藥相互作用現(xiàn)狀，細(xì)胞色素P450酶及其介導(dǎo)的植物藥-西藥相互作用，檢測(cè)細(xì)胞色素P450酶介導(dǎo)相互作用的方法，以及本研究中3種中藥單一成分應(yīng)用及其相關(guān)的藥物相互作用。
　　2.實(shí)驗(yàn)研究
　　(1)延胡索乙素、甲基蓮心堿和小檗堿對(duì)人細(xì)

4、胞色素1A2、2D6、3A4酶的體外抑制作用
　　本實(shí)驗(yàn)采用了酶體外孵育方法，以3種人重組細(xì)胞色素P450酶1A2、2D6和3A4為主要CYP代謝酶，研究3種中藥單一有效成分（延胡索乙素、甲基蓮心堿和小檗堿）對(duì)上述3種CYP酶代謝活性抑制作用。在體外酶反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，分別以非那西丁，右美沙芬和睪酮為細(xì)胞色素P450酶1A2、2D6和3A4的特異性底物，采用HPLC方法測(cè)定其代謝產(chǎn)物含量，并以代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生量來(lái)計(jì)算CYP酶活性。在本實(shí)驗(yàn)

5、中，用IC50值評(píng)價(jià)抑制作用的大小，以α-萘黃酮、奎尼丁和酮康唑分別作為CYP1A2、2D6和3A4的陽(yáng)性對(duì)照抑制劑。
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3種中藥單體成分對(duì)所觀察的CYP酶均具有不同程度的抑制作用。其中，CYP2D6的抑制作用最為顯著，延胡索乙素和小檗堿的IC50值分別為3.04±0.26μM和7.40±0.36μM。此外，3種中藥成分也對(duì)CYP3A4和CYP1A2也有一定的抑制作用，抑制作用強(qiáng)度依次為CYP2D6＞ CYP3A

6、4＞CYP1A2。在三種中藥成分中，甲基蓮心堿對(duì)所檢測(cè)CYP酶的抑制作用最弱。結(jié)合中藥成分結(jié)構(gòu)分析顯示，中藥成分對(duì)CYP酶的抑制作用強(qiáng)度可能與他們的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，延胡索乙素和小檗堿對(duì)CYP2D6和CYP3A4酶的抑制作用，可能會(huì)使其與其它藥物合用時(shí)產(chǎn)生臨床相關(guān)的代謝性相互作用。
　　(2)延胡索乙素、甲基蓮心堿和小檗堿對(duì)人細(xì)胞色素P450酶的體外抑制機(jī)制研究
　　在本實(shí)驗(yàn)中，采用了酶體外孵育方法，以3種人重組細(xì)

7、胞色素P450酶1A2、2D6和3A4為主要CYP代謝酶，研究3種中藥單一有效成分（延胡索乙素、甲基蓮心堿和小檗堿）對(duì)上述3種CYP酶代謝活性的抑制作用機(jī)制。在體外酶反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，分別以非那西丁，右美沙芬和睪酮為CYP1A2、2D6和3A4酶的特異性底物，采用HPLC方法測(cè)定其代謝產(chǎn)物含量，并以代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生量來(lái)計(jì)算CYP酶活性。在本實(shí)驗(yàn)中仍以α-萘黃酮、奎尼丁和酮康唑分別作為CYP1A2、2D6和3A4酶的陽(yáng)性對(duì)照抑制劑。分別用時(shí)間依賴

8、性、NADPH依賴性抑制作用試驗(yàn)和Lineweaver-Burk法，來(lái)分別評(píng)價(jià)其可逆性抑制作用和不可逆性抑制作用（機(jī)制基礎(chǔ)性抑制作用）機(jī)制。為了進(jìn)一步分析其抑制作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)還采用了Discovery Studio CDOCKER軟件進(jìn)行中藥成分與CYP酶之間相互作用計(jì)算機(jī)化模擬。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3種中藥成分對(duì)CYP3A4酶均顯示出相近且顯著的機(jī)制基礎(chǔ)性抑制作用。此外，延胡索乙素對(duì)CYP1A2和2D6酶也能產(chǎn)生機(jī)制基礎(chǔ)性抑制

9、作用，而小檗堿僅對(duì)CYP2D6產(chǎn)生機(jī)制基礎(chǔ)性抑制作用，而甲基蓮心堿和小檗堿對(duì)CYP1A2均未顯示出機(jī)制基礎(chǔ)性抑制作用?？赡嫘砸种蒲芯拷Y(jié)果提示，延胡索乙素和小檗堿均對(duì)CYP2D6和3A4酶，同時(shí)具有可逆性抑制作用。計(jì)算機(jī)化模擬酶-化合物相互作用分析結(jié)果顯示，延胡索乙素和小檗堿對(duì)CYP1A2、CYP2D6和CYP3A4酶的特異性氨基酸殘基均能展示出氫鍵和π鍵結(jié)合作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，延胡索乙素和小檗堿對(duì)CYP2D6和3A4酶活性即具有可逆

10、性又具有不可逆性抑制作用，提示延胡索乙素和小檗堿在臨床治療中與上述兩種酶底物藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，極有可能會(huì)產(chǎn)生相關(guān)的中藥-西藥相互作用。
　　(3)延胡索乙素對(duì)Beagle犬體內(nèi)CYP1A2、2D6和3A酶探針?biāo)幬锏拇x影響
　　延胡索乙素是由傳統(tǒng)中藥提取出的單一有效成分，具有多種藥理作用，并頻繁應(yīng)用于臨床實(shí)踐。特別在中國(guó)一直被廣泛應(yīng)用，近年來(lái)其應(yīng)用也顯著增加。本實(shí)驗(yàn)中采用 Cocktail探針?biāo)幬锓ǎ–ocktail prob

11、e法），研究延胡索乙素單次給藥和多次給藥對(duì)Beagle犬體內(nèi)CYP1A2、2D6和3A酶活性的影響。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，分別以咖啡因（3.0mg/kg），美托洛爾（2.33mg/kg）和咪達(dá)唑侖（0.45mg/kg）作為CYP1A2、2D6和3A酶的Cocktail特異性底物，采用HPLC法定量檢測(cè)底物及其主要代謝產(chǎn)物血漿濃度，以底物及其代謝產(chǎn)物血漿中含量的變化，顯示體內(nèi)CYP酶代謝活性的變化。
　　將6只雄性Beagle犬采用隨機(jī)分為

12、對(duì)照組和給藥組。實(shí)驗(yàn)分為2個(gè)階段。第1階段:延胡索乙素首次(D1)灌胃給藥（12mg/kg）的同時(shí)，灌胃給予含有3種CYP酶特異性底物的Cocktail探針?biāo)幬?，分別于藥前及藥后10min、20min、30min、45min、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、12h和24h取血，進(jìn)行24h內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究;此后，延胡索乙素連續(xù)灌胃給藥(每天給藥3次，每次12mg/kg，給藥間隔約8h)4天，于D6，延胡索乙素和Cocktai

13、l探針?biāo)幬锿瑫r(shí)灌胃給藥，再次進(jìn)行24h內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究。第1階段結(jié)束后，經(jīng)過(guò)7天洗脫期，將對(duì)照組和給藥組交叉對(duì)調(diào)，進(jìn)行第2階段實(shí)驗(yàn)，研究方法與第1階段相同。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用非房室模型，模擬計(jì)算各組的代謝參數(shù)，以Cmax、 Tmax、 AUC0-24h和AUC0-24h比作為主要代謝參數(shù)，對(duì)比兩組之間的差異，評(píng)價(jià)其給藥后對(duì)CYP酶活性的抑制作用。
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，延胡索乙素對(duì)Beagle犬體內(nèi)咖啡因和美托洛爾藥物代謝顯示出及其微弱

14、的影響，提示其對(duì)CYP1A2和2D6酶代謝活性無(wú)顯著作用。然而，相當(dāng)于臨床用量的延胡索乙素，無(wú)論單次或多次給藥，均能顯著增加咪達(dá)唑侖AUC0-24h（單次或多次給藥分別增加39％或57％）、顯著降低1-羥基咪達(dá)唑侖與咪達(dá)唑侖AUC(0-24h)比（單次或多次給藥分別增加29％或22％），與對(duì)照組比較均有顯著差異，提示其可能是通過(guò)CYP3A酶的抑制作用而引起咪達(dá)唑侖的體內(nèi)累積。這與我們前面的體外CYP3A4酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示

15、，延胡索乙素及其相關(guān)中藥的廣泛應(yīng)用于臨床，可能會(huì)帶來(lái)由CYP3A酶介導(dǎo)的中藥-西藥相互作用，有必要通過(guò)臨床研究進(jìn)一步確定其可能存在的藥物相互作用。
　　3.結(jié)論
　　體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3種中藥生物堿，延胡索乙素、甲基蓮心堿和小檗堿，對(duì)人CYP3A4、2D6和1A2酶活性均能產(chǎn)生一定的體外抑制作用，其作用強(qiáng)度與生物堿的結(jié)構(gòu)有關(guān)。而且，延胡索乙素和小檗堿均對(duì)CYP2D6和3A4酶，不僅具有可逆性抑制作用，而且具有不可逆性抑制作用