組蛋白脫乙酰酶抑制劑DMA-PB對創(chuàng)傷性腦損傷的作用及機(jī)制.pdf

1、研究目的：創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)能夠產(chǎn)生大量病理損害包括炎癥反應(yīng)。炎癥級鏈效應(yīng)以小膠質(zhì)細(xì)胞激活和致炎因子的產(chǎn)生為特征，進(jìn)而加重其他病理損傷。能夠干預(yù)致炎因子產(chǎn)生和膠質(zhì)細(xì)胞活化的藥物對TBI具有潛在的治療價(jià)值。目前大量研究顯示組蛋白脫乙酰酶(histonedeacetylase，HDAC)抑制劑的抗炎作用以及在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用前景。然而在TBI領(lǐng)域尚無報(bào)道。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)性

2、兒科TBI后海馬CA3區(qū)的乙酰化組蛋白表達(dá)降低，這種變化與TBI導(dǎo)致的興奮性毒性等損傷密切相關(guān)。因此HDAC抑制劑可能會(huì)對TBI的防治產(chǎn)生積極作用。 研究方法：本研究利用成年大鼠液壓沖擊損傷(fluid percussion injury，F(xiàn)PI)模型評價(jià)新型HDAC抑制劑DMA-PB對TBI的保護(hù)作用。采用乙酰組蛋白免疫組織化學(xué)方法檢測海馬CA2/3區(qū)組蛋白乙?；潭?，通過測量相對光密度評價(jià)乙?；M蛋白表達(dá)水平。以O(shè)X-42免

3、疫組織化學(xué)方法檢測海馬CA2/3區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的變化。通過對四種不同形態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞(靜息型、肥大型、活化型、吞噬型)的定量分析鑒別炎癥反應(yīng)程度。以Fluoro-Jade B組織熒光法觀察TBI后海馬CA2/3區(qū)早期神經(jīng)元變性。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)分別檢測海馬組織中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNFα)以及白介素1β(interlukin-1β，IL-1β)的含量。Morris水迷宮評價(jià)大鼠的空間記

4、憶及認(rèn)知功能。結(jié)晶紫染色分析海馬CA2/3區(qū)延遲性神經(jīng)元損傷。興趣區(qū)域(region of interest，ROI)為海馬組織。 結(jié)果：乙酰組蛋白免疫染色后，相對光密度的測量結(jié)果顯示損傷側(cè)海馬CA2/3區(qū)乙酰化組蛋白表達(dá)降低，新型HDAC抑制劑DMA-PB在0.25mg/kg、2.5mg/kg、25mg/kg的劑量下均明顯提高了組蛋白乙?；潭龋鲃┝拷M之間無顯著差異。OX-42免疫染色后，四種不同形態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞的定量分析

5、結(jié)果顯示假手術(shù)組以靜息型占絕對優(yōu)勢，顯著的高于其他各TBI組，無活化型及吞噬型，各TBI組以活化型及吞噬型為主，與模型組相比，HDAC抑制劑DMA-PB顯著的降低了TBI后吞噬型小膠質(zhì)細(xì)胞的密度，抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)程度，但各劑量組之間無顯著差異。Fluoro-JadeB組織熒光的定量分析結(jié)果顯示，假手術(shù)組無熒光標(biāo)記細(xì)胞，提示無神經(jīng)元變性發(fā)生，各TBI組變性神經(jīng)元在背景的襯托下發(fā)亮熒光，與模型組相比，HDAC抑制劑DMA-PB有減少

6、變性神經(jīng)元的趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中以高劑量組的抑制效果最明顯。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組損傷側(cè)海馬內(nèi)兩種炎癥因子的含量顯著增加，而HDAC抑制劑DMA-PB則明顯降低了TNFα及IL-1β的含量。Morris水迷宮結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠發(fā)現(xiàn)隱藏平臺(tái)的潛伏期明顯延長，提示記憶缺損，而HDAC抑制劑DMA-PB高劑量組(25mg/kg)的潛伏期顯著縮短，改善了TBI所致的認(rèn)知損害，中低劑量組(2.5m

7、g/kg、0.25mg/kg)只呈現(xiàn)縮短趨勢無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組海馬神經(jīng)元形態(tài)正常，細(xì)胞邊界清晰，胞膜完整，胞核規(guī)則，核仁清晰可見，損傷后細(xì)胞皺縮明顯，形態(tài)不規(guī)則，神經(jīng)元典型的多層排列結(jié)構(gòu)被破壞，且細(xì)胞數(shù)量明顯減少，與模型組相比，HDAC抑制劑DMA-PB高劑量(25mg/kg)顯著增加了神經(jīng)元密度，而中低劑量(2.5mg/kg、0.25mg/kg)對細(xì)胞數(shù)量的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)TBI

8、可致成年大鼠海馬組蛋白脫乙酰化。新型HDAC抑制劑DMA-PB可能以一種間接作用逆轉(zhuǎn)組蛋白脫乙?；２⑶褼MA-PB各劑量均可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)及炎癥因子TNFα、IL-1β的產(chǎn)生，顯示出強(qiáng)大的抗炎作用。對TBI后早期神經(jīng)元變性，DMA-PB具有減少趨勢，但對延遲性神經(jīng)元損傷及空間記憶認(rèn)知功能的損壞，高劑量組呈現(xiàn)明顯的改善作用?？梢?，DMA-PB對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷具有保護(hù)作用，尤以抗炎作用顯著，并抑制神經(jīng)元變性而改善神經(jīng)功能。

9、 意義：本課題首次研究了新型組蛋白脫乙酰酶抑制劑DMA-PB對創(chuàng)傷性腦損傷的作用，發(fā)現(xiàn)DMA-PB可抑制早期小膠質(zhì)細(xì)胞活化等炎癥反應(yīng)，并改善延遲性神經(jīng)元損傷及記憶認(rèn)知功能，對組蛋白脫乙酰酶抑制劑的抗炎性能及在創(chuàng)傷性腦損傷中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)首次發(fā)現(xiàn)成年大鼠液壓沖擊性創(chuàng)傷性腦損傷后海馬CA2/3區(qū)組蛋白乙?；档停珼MA-PB可能通過間接作用提高組蛋白乙?；瑸閯?chuàng)傷性腦損傷的病理生理機(jī)制增加了新的內(nèi)容，也為深入闡明DMA-PB的