組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA對(duì)DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)路徑的作用.pdf

1、目的：DNA分子結(jié)構(gòu)的完整性對(duì)細(xì)胞生存至關(guān)重要。細(xì)胞內(nèi)DNA損傷存在多種類型，其中DNA雙鏈斷裂(DNA double strand break，DSB)對(duì)細(xì)胞影響最為嚴(yán)重，對(duì)細(xì)胞生存是致命的。通過在腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生DNA損傷，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期中止、壞死和凋亡是臨床放、化療的主要目的。但細(xì)胞中DNA損傷修復(fù)路徑的存在，削弱了腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的敏感性。組蛋白去乙酰化酶是目前抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)，有研究證明，其抑制劑能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)受損DN

2、A修復(fù)，大幅提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放、化療的敏感性，而對(duì)人正常細(xì)胞影響較小。本研究通過Ⅱ型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，依托泊苷(Etoposide)在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生DSB損傷，探索組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA對(duì)腫瘤細(xì)胞DSB路徑的影響，初步研究組蛋白去乙?；敢种苿?duì)DSB修復(fù)通路的作用機(jī)制，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SAHA對(duì)同源染色體指導(dǎo)的重組修復(fù)路徑(homologous direct recombination，HDR)的抑制效率

3、，為高效抗腫瘤藥物的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：利用Ⅱ型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑Etoposide(VP-16)，在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中誘導(dǎo)DSB損傷產(chǎn)生，免疫熒光檢測(cè)DSB損傷標(biāo)志物-磷酸化變異組蛋白H2A(histone variant H2A phosphorylated at serine139，γ-H2Ax)的生成。DNA瓊脂糖電泳，觀察VP-16作用MCF-7細(xì)胞后基因組DNA斷裂產(chǎn)生的涂抹狀Smear條帶形成，

4、佐證DSB損傷的存在。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察SAHA對(duì)VP-16誘導(dǎo)的DSB損傷修復(fù)的影響。使用CCK-8試劑盒檢測(cè)組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA對(duì)腫瘤細(xì)胞MCF-7及人正常細(xì)胞HEK293的細(xì)胞增殖毒性作用。Real-TimePCR檢測(cè)SAHA的加入，對(duì)DSB修復(fù)相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響，Western-Bloting檢測(cè)SAHA對(duì)DSB修復(fù)蛋白在染色體結(jié)合蛋白水平上的改變。流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)SAHA對(duì)HDR路徑修復(fù)效率的改變。

5、>　　 結(jié)果：⑴DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑Etoposiden(VP-16)可在MCF-7細(xì)胞中有效誘導(dǎo)產(chǎn)生DSB損傷。⑵組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA可抑制MCF-7細(xì)胞內(nèi)DSB修復(fù)能力，但SAHA對(duì)人正常細(xì)胞HEK293無顯著抑制作用，并且這一現(xiàn)象與SAHA抑制HDR及C-NHEJ路徑關(guān)鍵修復(fù)基因rad51、kuS0、rpa70的mRNA水平表達(dá)，下調(diào)修復(fù)蛋白R(shí)ad51、Ku80、RPA70在染色體損傷位點(diǎn)結(jié)合能力相關(guān)。⑶流式細(xì)胞儀檢

6、測(cè)SAHA對(duì)MCF-7細(xì)胞中HDR路徑修復(fù)效率抑制呈劑量依賴，0.5μM、1.5μM及4.5μM藥物可使HDR路徑修復(fù)效率分別下降9.9％、42.3％和64.7％
　　 結(jié)論：①乳腺癌MCF-7相對(duì)于人對(duì)正常細(xì)胞HEK293細(xì)胞，對(duì)SAHA的細(xì)胞毒性作用更為敏感。②SAHA可下調(diào)HDR及C-NHEJ路徑關(guān)鍵修復(fù)基因rad51、ku80、rpa70的mRNA水平表達(dá)，并干擾修復(fù)蛋白R(shí)ad51、Ku80、RPA70結(jié)合于染色體損傷位