豬圓環(huán)病毒感染性分子克隆構(gòu)建及siRNA對(duì)rep基因表達(dá)抑制研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(PCV)是當(dāng)前嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一。PCV除了是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎和腎病綜合征(PDNS)等新發(fā)重大傳染病的“罪魁禍?zhǔn)住敝?，還可以導(dǎo)致母豬繁殖障礙、豬呼吸道綜合征、仔豬先天性震顫等諸多疾病。同時(shí)，該病毒感染主要侵害機(jī)體的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫抑制，造成繼發(fā)感染。PCV對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成的直接、間接損失十分巨大，從而備受世界獸醫(yī)界的關(guān)注。此外，豬群中廣泛存在著PCV感染，在豬的器官及食源性產(chǎn)品中P

2、CV檢出率也較高。故PCV還存在突破種間屏障并通過食物或器官移植等途徑傳播給人的潛在可能。但到目前，世界上還沒有一種有效方法應(yīng)對(duì)PCV感染。尋求預(yù)防、治療PCV感染的途徑顯得尤為迫切。 本論文主要在PCV的診斷方法、感染性分子克隆和siRNA對(duì)PCV1rep基因表達(dá)的抑制作用等三方面開展了研究，為PCV的基因功能和免疫預(yù)防研究奠定基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容如下：1.PCV2、PRV和PPV多重PCR診斷方法的建立與應(yīng)用利用三對(duì)PCR引物

3、建立了同時(shí)檢測豬Ⅱ型圓環(huán)病毒(PCV2)、豬偽狂犬病毒(PRV)和豬細(xì)小病毒(PPV)的多重PCR診斷方法。用該方法對(duì)137份PCV2陽性病料進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示：在137份PCV2陽性病料中有78份同時(shí)檢測到了PPV，46份檢測到了PRV，35份檢測到了PRV和PPV，檢測結(jié)果與已經(jīng)建立的單一PCR方法完全相同。表明：建立的多重PCR具有高度的準(zhǔn)確性，可以用于臨床PCV2、PRV和PPV的快速診斷；PPV和PRV易與PCV2發(fā)生混

4、合感染，并在導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。 2.PCV1感染性分子克隆的構(gòu)建從IBRS-2細(xì)胞中分離鑒定了PCV1，并通過PCR方法獲得了其全基因組序列，序列分析表明該毒株與其它PCV1毒株間的同源性都在98％以上；構(gòu)建了PCV．1雙拷貝全基因組串連質(zhì)粒pSK2PCV1，經(jīng)RT-PCR和間接免疫熒光初步證實(shí)pSK2PCV1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞后可以形成具有感染性的病毒。 3.嵌合病毒PCV1-2感染性分子克隆的構(gòu)建利

5、用PCR方法，將PCV2的ORF2基因替換了PCV1的ORF2基因，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了雙拷貝的嵌合病毒(PCV1-2)分子克隆(pSK2PCV1-2)；將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞并連續(xù)盲傳5代，用RT-PCR方法可以在轉(zhuǎn)染后盲傳的細(xì)胞中檢測到PCV1的ORF1mRNA和PCV2的ORF2mRNA基因，但檢測不到PCV1的ORF2基因mRNA和PCV2的ORF1基因mRNA;間接免疫熒光檢測顯示在盲傳第5代的細(xì)胞中有PCV2ORF2蛋白的

6、表達(dá)，表達(dá)蛋白主要分布于細(xì)胞核。表明：構(gòu)建的PCV1-2分子克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞后形成了具有感染性的嵌合病毒。 4.siRNA對(duì)PCV1rep基因表達(dá)的抑制作用研究以PCV1的ORF1基因的mRNA為靶序列，設(shè)計(jì)合成了3個(gè)siRNA，并構(gòu)建了各自的表達(dá)質(zhì)粒；構(gòu)建了rep基因與EGFP融合的真核表達(dá)質(zhì)粒(pCDPCV1ORF1-EGFP)，并實(shí)現(xiàn)了二者在PK-15細(xì)胞中的融合表達(dá)，rep基因表達(dá)蛋白呈彌散性分布于整個(gè)細(xì)胞；將siRNA表達(dá)

7、質(zhì)粒與pCDPCV1ORF1-EGFP共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞后，通過熒光觀察、流式細(xì)胞和半定量RT-PCR等方法證實(shí)：3個(gè)siRNA均對(duì)rep基因的表達(dá)產(chǎn)生了顯著的抑制作用，其中siRNA(C)的抑制作用最強(qiáng)，siRNA(B)次之，siRNA(A)最弱。 5.以EGFP為報(bào)告基因的PCV1分子克隆的構(gòu)建利用PCR方法將報(bào)告基因EGFP插入到PCV1的ORF2基因的下游，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了包含EGFP的雙拷貝PCV1的分子克隆(pS