桑根黃酮降血糖效應(yīng)及其作用機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，與心腦血管疾病和腫瘤共同成為人類(lèi)的“三大健康殺手”。目前，中國(guó)已成為糖尿病患者最多的國(guó)家，其中II型糖尿病約占發(fā)病率的95％以上，并呈現(xiàn)低齡化、病死率增多的快速增長(zhǎng)趨勢(shì)。在自然界中，黃酮類(lèi)化合物主要來(lái)源于植物的次生代謝產(chǎn)物，通常具有苯并色原酮的基本母核，已發(fā)現(xiàn)的黃酮類(lèi)化合物達(dá)4000多種，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變，具有多種藥理活性，如抗氧化、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、降血糖、降血壓、抑菌和防治呼吸系統(tǒng)疾病等。黃酮類(lèi)

2、化合物是桑根皮中的重要活性成分之一，具有降血糖作用，且效果顯著，但其作用機(jī)制尚不明確。因此，深入探討桑根皮黃酮類(lèi)化合物降血糖的作用機(jī)制，可為開(kāi)發(fā)良好的降血糖藥物提供重要的理論參考價(jià)值。本研究從桑根皮總黃酮的提取工藝出發(fā)，考察提取時(shí)間、乙醇體積濃度和原料質(zhì)量濃度三個(gè)對(duì)桑根皮總黃酮提取率影響較大的因素進(jìn)行交互影響和分析；進(jìn)一步對(duì)桑根皮提取物進(jìn)行硅膠柱層析，分離純化，并利用HPLC對(duì)黃酮化合物進(jìn)行分析，建立HPLC指紋圖譜；在此基礎(chǔ)上，對(duì)所得

3、的桑根皮不同部位和單體化合物進(jìn)行體外酶抑制活性篩選；最后通過(guò)3T3-L1前脂肪細(xì)胞建立的胰島素抵抗模型探討桑根皮總黃酮的降血糖作用機(jī)制，為研制桑根皮總黃酮的降血糖藥物提供理論支持和技術(shù)參考。主要研究結(jié)果如下：
　　1、桑根皮總黃酮提取工藝優(yōu)化：選取塘10品種的桑根皮作為原材料，選取提取時(shí)間、乙醇體積濃度和原料質(zhì)量濃度作為單因素條件，利用超聲波輔助提取，以Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化提取工藝條件，桑根皮總黃酮得率為

4、響應(yīng)值，建立回歸模型，采用Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，確定超聲波輔助提取桑根皮總黃酮最佳工藝條件為：提取時(shí)間1.66 h，原料質(zhì)量濃度0.04 g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)79.70%。實(shí)際操作時(shí)將其修正為提取時(shí)間1.6 h，原料質(zhì)量濃度0.04 g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)80.0%。采用此優(yōu)化的工藝條件提取桑根皮總黃酮的得率達(dá)到3.63%，預(yù)測(cè)值為3.71%。采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化桑根皮總黃酮的提取工藝條件具有較好的實(shí)際

5、應(yīng)用價(jià)值，為桑根皮功能性成分的研究奠定了一定的原料基礎(chǔ)。
　　2、桑根皮提取分離及HPLC分析：利用硅膠柱層析、制備型HPLC等手段對(duì)桑根皮提取物進(jìn)行分離純化，得到4個(gè)單體化合物，鑒定其為熊果酸、β-谷甾醇、桑根皮素和白樺脂酸；同時(shí)，對(duì)桑根皮總黃酮提取物進(jìn)行極性分部萃取，分別得到石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相和水相等不同極性部位，運(yùn)用HPLC對(duì)桑根皮黃酮提取物進(jìn)行指紋圖譜分析，比較分析桑根皮中黃酮單體含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含量

6、最多的是山奈素，其次是桑根皮素和桑皮黃素，最少的是異槲皮苷和桑黃酮E。通過(guò)此部分實(shí)驗(yàn)，為桑根皮黃酮HPLC指紋圖譜的研究奠定理論依據(jù)，也為后期體外酶活性篩選提供樣品。
　　3、體外降血糖活性評(píng)價(jià)：以桑根皮中得到的4個(gè)單體化合物和不同極性萃取部位為試驗(yàn)樣品，綜合考察其體外α-葡萄糖苷酶抑制活性、蔗糖酶抑制活性、PTP1B酶抑制活性，以及DPPH自由基清除能力和FRAP體外抗氧化能力。結(jié)果表明，從桑根皮中所獲得的樣品對(duì)三種血糖相關(guān)酶均

7、有一定抑制作用，但抑制能力強(qiáng)弱存在差異。桑根皮黃酮粗提物、乙酸乙酯萃取相和桑根皮素抑制效果明顯，且同時(shí)對(duì)兩種酶（α-葡萄糖苷酶和 PTP1B酶）表現(xiàn)出顯著性抑制作用；而在抗氧化活性評(píng)價(jià)中，正丁醇萃取相同時(shí)表現(xiàn)出強(qiáng)的DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力（FRAP），桑根皮粗提物和乙酸乙酯萃取相表現(xiàn)出較強(qiáng)的總抗氧化能力（FRAP）。
　　4、桑根黃酮降血糖作用機(jī)制初探：利用3T3-L1前脂肪細(xì)胞建立胰島素抵抗模型，考察桑根黃酮對(duì)脂肪細(xì)

8、胞增殖分化的影響，以及其對(duì) PI3K-Akt信號(hào)通路中關(guān)鍵因子PPARγ、IR、PI3K、Akt、GLUT-4、PTP1B的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，與模型組相比，桑根黃酮能改善3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗，上調(diào)PPARγ、IR、PI3K、Akt、GLUT-4基因表達(dá)水平，下調(diào)PTP1B基因表達(dá)水平，而對(duì)蛋白表達(dá)的影響并未與基因表達(dá)呈現(xiàn)一致性，推測(cè)可能與基因片段的內(nèi)含子與外顯子及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等因素有關(guān)。綜上所述，桑根黃酮降