巨噬細(xì)胞過(guò)氧化物酶體與鼠傷寒沙門菌相互作用的初步分析.pdf

1、鼠傷寒沙門菌屬于腸桿菌科，是重要的腸道致病菌，致病譜從自限性的胃腸炎到危及生命的全身性系統(tǒng)疾病。沙門菌是兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，在感染致病過(guò)程中侵入許多吞噬和非吞噬細(xì)胞并在宿主細(xì)胞內(nèi)寄生存活。巨噬細(xì)胞是鼠傷寒沙門菌感染的重要宿主，在疾病的發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中起重要作用。感染鼠傷寒沙門菌的宿主細(xì)胞啟動(dòng)誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）系統(tǒng)產(chǎn)生一氧化氮（nitric oxide, NO）及活性氮

2、化合物（reactive nitrogen species，RNS）抑制和殺滅細(xì)胞內(nèi)沙門菌。iNOS在不同細(xì)胞可定位于胞漿、囊泡和過(guò)氧化物酶體。本研究中，使用活的和滅活的鼠傷寒沙門菌（ATCC 14028）感染鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7）和昆明小鼠。研究感染過(guò)程中巨噬細(xì)胞iNOS、過(guò)氧化物酶體膜表面蛋白70（The 70-kDa PeroxisomAlMembrane Protein，PMP70）的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)鼠傷寒沙門菌數(shù)量的關(guān)系；

3、使用iNOS選擇性抑制劑1400W（N-(3-[Aminomethyl]benzyl)acetamidine）預(yù)處理巨噬細(xì)胞，檢測(cè)活菌感染細(xì)胞的培養(yǎng)液NO濃度、計(jì)數(shù)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量；檢測(cè)感染昆明小鼠血漿和肝臟NO濃度。對(duì)比以上檢測(cè)活菌和滅活菌間的差異，及隨感染時(shí)間變化的差異，探討鼠傷寒沙門菌感染的特點(diǎn)；對(duì)比使用和未使用1400W處理感染細(xì)胞的結(jié)果，探討iNOS在沙門菌感染中的作用。研究感染巨噬細(xì)胞內(nèi)iNOS、過(guò)氧化物酶體和沙門菌三者之間的

4、定位關(guān)系，探討過(guò)氧化物酶體的抗菌功能，為沙門菌感染的治療提供依據(jù)。
　　 一、鼠傷寒沙門菌感染巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)iNOS表達(dá)的檢測(cè)
　　 用活的和滅活的鼠傷寒沙門菌以細(xì)菌：細(xì)胞比為20：1，即感染復(fù)數(shù) （Multiplicity of Infection，MOI）為20，感染RAW264.7 1h，用PBS洗掉細(xì)胞外游離細(xì)菌并繼續(xù)培養(yǎng)到指定時(shí)間（1h、4h、8h、12h、24h）做以下檢測(cè)。提取活菌和滅活菌兩感染組各感染時(shí)間的

5、細(xì)胞總RNA，用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄cDNA做實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time PCR）以GAPDH為參比基因檢測(cè)目的基因iNOS。用Griess試劑測(cè)定兩感染組各感染時(shí)間的細(xì)胞培養(yǎng)液NO濃度。結(jié)果顯示兩感染組均在感染的前12h iNOS mRNA表達(dá)呈持續(xù)升高。在12h達(dá)最高值，活菌感染和滅活菌感染分別為未感染對(duì)照的21.723倍和22.051倍，兩數(shù)據(jù)間比較無(wú)明顯差異。而在1h、4h、8h、24h時(shí)滅活菌感染細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá)

6、均顯著高于活菌感染細(xì)胞的表達(dá)。兩感染組細(xì)胞培養(yǎng)液NO濃度同樣在感染的前12h表達(dá)呈持續(xù)升高，在12h達(dá)最高值后下降。在相同的各指定時(shí)間點(diǎn)活菌感染的細(xì)胞上清NO濃度均顯著低于滅活菌感染組。總之活菌感染和滅活菌感染均能顯著誘導(dǎo)RAW264.7 iNOS mRNA的表達(dá)和NO濃度的升高，但滅活菌比活菌誘導(dǎo)能力更強(qiáng)。這些結(jié)果說(shuō)明鼠傷寒沙門菌感染能顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞iNOS的表達(dá)。
　　 結(jié)合感染細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果表明，活菌對(duì)iNOSmRN

7、A的表達(dá)和NO的生成有抑制作用。
　　 二、鼠傷寒沙門菌感染巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌計(jì)數(shù)
　　 用活菌和滅活的鼠傷寒沙門菌以MOI=20感染RAW264.7 1h，用PBS洗掉細(xì)胞外游離細(xì)菌并繼續(xù)培養(yǎng)到指定時(shí)間（1h、4h、8h、12h、24h）。取活菌和滅活菌感染各時(shí)間的細(xì)胞爬片，用4％多聚甲醛固定，做免疫熒光標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)沙門菌，在熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。收集活菌感染各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，用0.1％Triton X-100PBS

8、裂解細(xì)胞。取裂解液用LB平板做細(xì)菌培養(yǎng)，計(jì)數(shù)平板的菌落數(shù)，計(jì)算細(xì)胞內(nèi)的活菌數(shù)。對(duì)細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示活菌感染的免疫熒光染色細(xì)菌計(jì)數(shù)和裂解細(xì)胞細(xì)菌計(jì)數(shù)間差異顯著，結(jié)合兩種計(jì)數(shù)方法的特點(diǎn)，差異為細(xì)胞內(nèi)部分活菌被細(xì)胞殺滅?；罹腥镜拿庖邿晒庥?jì)數(shù)和裂解細(xì)胞活菌計(jì)數(shù)顯示，在前12h內(nèi)細(xì)菌數(shù)量逐漸增多，在12h達(dá)最大值。1h、4h、8h兩計(jì)數(shù)方法結(jié)果間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在12h和24h兩計(jì)數(shù)結(jié)果間差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在24h免疫

9、熒光細(xì)菌計(jì)數(shù)為13.857個(gè)/細(xì)菌為裂解細(xì)胞活菌計(jì)數(shù)7.940個(gè)/細(xì)菌的1.744倍，有顯著差異，即此時(shí)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌部分被殺滅。滅活菌感染細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌計(jì)數(shù)在不同時(shí)間點(diǎn)計(jì)數(shù)間差異顯著，即細(xì)菌因被細(xì)胞降解而減少。結(jié)合感染細(xì)胞的熒光顯微鏡圖片，滅活菌被細(xì)胞降解逐漸變小成細(xì)顆粒。以上結(jié)果結(jié)合iNOS表達(dá)的結(jié)果說(shuō)明活的鼠傷寒沙門菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞iNOS表達(dá)，生成殺菌物質(zhì)NO，濃度達(dá)到一定水平細(xì)菌被殺滅，滅活的細(xì)菌被細(xì)胞降解。
　　

10、 三、1400W預(yù)處理巨噬細(xì)胞感染各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)液NO濃度和細(xì)胞內(nèi)沙門菌計(jì)數(shù)
　　 將巨噬細(xì)胞接種在6孔板，使用1400W終濃度為50umol/L的10％DMEM預(yù)處理24h。然后以MOI=20用鼠傷寒沙門菌活菌感染巨噬細(xì)胞1h，用PBS洗掉細(xì)胞外游離細(xì)菌并繼續(xù)培養(yǎng)到指定時(shí)間（1h、4h、8h、12h、24h），在培養(yǎng)細(xì)胞整個(gè)過(guò)程中均使用1400W終濃度為50umol/L的10％DMEM。使用Griess試劑檢測(cè)感染各時(shí)間點(diǎn)培

11、養(yǎng)液的NO濃度。通過(guò)免疫熒光染色沙門菌和使用0.1％Triton X-100PBS裂解細(xì)胞做細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。結(jié)果顯示1400W處理細(xì)胞未感染及感染各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)液NO濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其NO濃度顯著低于未使用1400W處理的感染細(xì)胞培養(yǎng)液NO濃度，即感染細(xì)菌誘導(dǎo)的iNOS活性被1400W完全抑制。1400W處理后各感染時(shí)間的感染細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的兩種方法計(jì)數(shù)結(jié)果均比未使用1400W處理感染細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的相同方法細(xì)菌計(jì)數(shù)明顯增多。1

12、400W處理的感染細(xì)胞免疫熒光染色細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌計(jì)數(shù)和裂解細(xì)胞存活菌計(jì)數(shù)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果說(shuō)明，使用1400W抑制iNOS活性，殺菌物質(zhì)NO生成顯著減少，在低濃度NO時(shí)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌增殖和存活均顯著高于未使用1400W處理的感染細(xì)胞。
　　 四、昆明小鼠感染鼠傷寒沙門菌期間血漿和肝臟NO濃度的檢測(cè)
　　 用活菌和滅活的鼠傷寒沙門菌以1.75×107個(gè)/只，腹腔接種感染昆明小鼠。分別在感染后1h、4h、8h、12h、24

13、h取血分離血漿，斷頸處死小鼠解剖取肝臟，檢測(cè)血漿和肝組織的NO濃度。結(jié)果顯示活菌比滅活菌感染能顯著引起小鼠血漿和肝組織NO濃度升高。活菌感染的昆明小鼠血漿NO濃度在1h時(shí)即明顯升高，隨后逐漸升高在12h達(dá)最高值，為未感染組的5.823倍；肝組織NO濃度在感染后升高，在8h～12h持續(xù)處于高水平。滅活菌感染的昆明小鼠血漿和肝組織NO濃度升高變化平緩。相同時(shí)間點(diǎn)活菌和滅活菌感染小鼠的血漿NO濃度均有顯著差異；相同時(shí)間點(diǎn)活菌和滅活菌感染小鼠的

14、肝組織NO濃度在1h時(shí)無(wú)顯著差異，其他時(shí)間點(diǎn)有顯著差異。這些結(jié)果說(shuō)明活菌比滅活菌感染更易引起小鼠血漿和肝臟生成NO，沙門菌感染至肝臟時(shí)誘導(dǎo)肝細(xì)胞NO生成。
　　 五、鼠傷寒沙門菌感染巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)PMP70mRNA表達(dá)的檢測(cè)
　　 提取活菌和滅活菌以MOI=20感染RAW264.7細(xì)胞1h并培養(yǎng)到指定各時(shí)間點(diǎn)（1h、4h、8h、12h、24h），提取細(xì)胞總RNA，用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄cDNA，做實(shí)時(shí)定量PCR，以GAPDH為參

15、比基因檢測(cè)目的基因PMP70。結(jié)果顯示，活菌感染各時(shí)間點(diǎn)PMP70mRNA的表達(dá)差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；滅活菌感染各時(shí)間點(diǎn)PMP70mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；罹蜏缁罹鷮?duì)PMP70mRNA表達(dá)的誘導(dǎo)存在顯著差異?；罹腥窘MPMP70mRNA表達(dá)隨時(shí)間升高后降低在8h達(dá)最高值為對(duì)照的2.307倍，8h、12h和24h均顯著高于對(duì)照組和相同時(shí)間點(diǎn)的滅活菌感染組。結(jié)果說(shuō)明活菌比滅活菌感染更能有效誘導(dǎo)PMP70mRNA的表達(dá)。
　

16、　 六、感染巨噬細(xì)胞內(nèi)iNOS、過(guò)氧化物酶體和鼠傷寒沙門菌的定位關(guān)系的研究
　　 用鼠傷寒沙門菌以MOI=20感染鼠巨噬細(xì)胞1h并培養(yǎng)到12h。做免疫熒光兩兩標(biāo)記iNOS、過(guò)氧化物酶體、鼠傷寒沙門菌，通過(guò)共聚焦熒光顯微鏡觀察三者在細(xì)胞內(nèi)的定位關(guān)系。用鼠傷寒沙門菌以MOI=20感染鼠巨噬細(xì)胞1h并培養(yǎng)到12h，用免疫膠體金標(biāo)記過(guò)氧化物酶體，通過(guò)透射電鏡觀察過(guò)氧化物酶體與鼠傷寒沙門菌的定位關(guān)系。免疫熒光結(jié)果顯示在感染的巨噬細(xì)胞內(nèi)i

17、NOS、過(guò)氧化物酶體、鼠傷寒沙門菌存在兩兩的共定位關(guān)系。電鏡結(jié)果顯示標(biāo)記金顆粒的過(guò)氧化物酶體和含沙門菌囊泡緊靠在一起。結(jié)果說(shuō)明感染巨噬細(xì)胞內(nèi)iNOS定位于過(guò)氧化物酶體參與細(xì)胞內(nèi)沙門菌的殺滅。
　　 本課題實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鼠傷寒沙門菌的感染能有效誘導(dǎo)宿主細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá)和殺菌物質(zhì)NO的生成，殺菌物質(zhì)達(dá)到一定水平時(shí)，感染細(xì)胞內(nèi)部分沙門菌被殺滅?；罹腥緦?duì)巨噬細(xì)胞iNOS的表達(dá)有抑制作用。1400W選擇性抑制iNOS活性后，