過氧化物酶體增殖物激活受體γ在狼瘡腎炎中的作用研究.pdf

1、PPAR γ在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)以及腎臟病理生理過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。我們假設(shè)LN時機(jī)體及腎臟局部存在PPAR γ及其信號傳導(dǎo)異常，不能有效地對免疫及炎癥反應(yīng)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，可能是LN時腎臟局部炎癥細(xì)胞浸潤活化、克隆增殖和釋放炎癥因子的重要機(jī)制；通過激活PPAR γ介導(dǎo)的信號通路負(fù)反饋調(diào)節(jié)LN狀態(tài)下機(jī)體免疫反應(yīng)并改善。腎臟局部炎癥反應(yīng)，可能為LN的治療提供新的治療靶點(diǎn)。圍繞這一假設(shè)，本課題擬進(jìn)行下列研究： 1.狼瘡腎炎患者腎組織

2、PPAR γ表達(dá)及其臨床意義。 目的：觀察PPAR γ在不同病理類型LN患者腎組織中的表達(dá)及其與腎臟病理改變之間的關(guān)系，探討PPAR γ在LN發(fā)病機(jī)制中的可能作用。 方法：根據(jù)臨床及腎活檢病理診斷，選擇LN不同病理類型患者作為研究對象，其中Ⅱ型6例，Ⅳ型8例，Ⅴ型7例。以腎臟腫瘤切除術(shù)中遠(yuǎn)離腫瘤部位的正常腎組織(5例)為對照。光鏡下觀察并計數(shù)。腎臟病理活動指數(shù)；用免疫組織化學(xué)方法對腎組織PPAR γ表達(dá)進(jìn)行檢測，并對其與

3、。腎臟病理活動指數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行分析。 結(jié)果：正常對照組PPAR γ主要表達(dá)在近端腎小管上皮細(xì)胞、髓質(zhì)集合管，陽性染色定位于細(xì)胞核，腎小球中無明顯的表達(dá)；LN患者腎組織腎小管、腎小球細(xì)胞中PPAR γ表達(dá)較正常對照組均顯著上調(diào)，其中Ⅳ型LN患者腎組織腎小管、腎小球細(xì)胞PPAR γ表達(dá)顯著高于Ⅱ型、Ⅴ型；腎小球PPAR γ染色陽性細(xì)胞數(shù)目與腎臟病理活動指數(shù)積分之間呈顯著正相關(guān)(r=0.79;P<0.01)。 結(jié)論：LN患者腎

4、組織中PPAR γ表達(dá)升高，并與腎臟病理變化顯著相關(guān)，提示PPARγ作為機(jī)體損傷和炎癥應(yīng)激反應(yīng)中的一個重要靶點(diǎn)，參與了LN的發(fā)生發(fā)展。 2.15d-PGJ<,2>對人腎小管上皮細(xì)胞CD40及RANTES表達(dá)的影響。 目的：通過觀察PPAR γ內(nèi)源性天然激動劑15-脫氧前列腺素J<,2>(15d-PGJ<,2>)對體外培養(yǎng)人近端腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)CD40及RANTES表達(dá)的影響，旨在揭示PPAR γ在LN腎小管間

5、質(zhì)炎癥中的作用。 方法：體外培養(yǎng)人近端腎小管上皮細(xì)胞株，分組如下：(1)正常對照組；(2)IFN7(50μ g/ml)組；(3)TNFα(10ng/ml)組；(4)IFNy(50μ g/ml)+TNFα(10ng/ml)組；(5)IFN γ(50 μ g/ml)+TNFα(10ng/ml)分別加1、3、5 μ mol/L 15d-PGJ<,2>組；(6)IFN γ+TNFα刺激+15d-PGJ<,2>(5 μ mol/L)+GW

6、9662(PPAR γ特異拮抗劑)1 μ mol/L組。GW9662和15d-PGJ<,2>分別于IFN γ和TNFα刺激前3h和2h加入。分別采用RT-PCR、流式細(xì)胞儀(FACS)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測CD40和RANTES基因和蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：正常HK-2細(xì)胞結(jié)構(gòu)性表達(dá)CD40、RANTES。IFN γ能顯著上調(diào)HK-2細(xì)胞CD40蛋白表達(dá)；TNFα單獨(dú)刺激對CD40表達(dá)無顯著影響，但能顯著增強(qiáng)IFNγ的刺激

7、效應(yīng)。IFN γ+TNFα顯著增加HK-2細(xì)胞RANTES的表達(dá)和分泌。15d-PGJ<,2>能夠基因和蛋白水平顯著抑制IFN γ+TNFα誘導(dǎo)的CD40和RANTES的表達(dá)。加入PPAR γ特異拮抗劑GW9662后，能夠部分逆轉(zhuǎn)15d-PGJ<,2>10對CD40和RANTES表達(dá)的抑制效應(yīng)，但并不能完全阻斷其作用。 結(jié)論：15d-PGJ<,2>部分通過PPAR γ介導(dǎo)的信號途徑抑制IFN γ+TNFα誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)

8、胞CD40和RANTES的表達(dá)，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎效應(yīng)。 3．PPAR γ在慢性移植物抗宿主病狼瘡樣小鼠模型中的作用研究。 目的：觀察慢性移植物抗宿主病(cGVHD)狼瘡樣小鼠模型腎組織中PPAR γ的表達(dá)變化以及PPAR γ天然配體15d-PGJ<,2>對cGVHD狼瘡樣小鼠尿蛋白、腎功能、腎小球免疫復(fù)合物沉積與腎組織病理改變的影響，從體內(nèi)水平進(jìn)一步揭示PPARγ在LN發(fā)病中的作用及其作為治療靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)的有效性。

9、 方法：雌性(DBA/2×C57BL/10)F1雜交鼠18只，隨機(jī)分成正常對照組6只，模型組12只。無菌分離DBA/2小鼠脾臟、胸腺及淋巴結(jié)，制備淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液；模型組分別在第0、3、7、10天按5×10<'7>個淋巴細(xì)胞/次/只尾靜脈注射到F1雜交鼠體內(nèi)；對照組給予等體積生理鹽水。模型誘導(dǎo)結(jié)束后，將小鼠隨機(jī)分為模型對照組(N=6)、15d-PGJ<,2>(200μg/kg/d)治療組(N=6)。治療組每日腹腔注射給藥，模型

10、組及正常對照組給予等體積生理鹽水。從給藥開始，每周用試紙法測定小鼠蛋白尿。第12周實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死動物，常規(guī)生化方法檢測血清肌酐、尿素氮；常規(guī)腎臟病理光鏡觀察腎臟病理變化；免疫熒光檢測腎臟IgG沉積，RT-PCR檢測腎組織PPAR γ及CD40mRNA表達(dá)變化，Western-blot及免疫組化檢測腎臟PPAR γ蛋白表達(dá)及其分布變化，同時免疫組化檢測腎組織CD3、CD40表達(dá)，流式細(xì)胞儀測定脾細(xì)胞中CD40表達(dá)。結(jié)果與正常組比較，cGVH

11、D模型組蛋白尿顯著高于正常，血尿素氮、肌酐均明顯升高[8.04±2.11 vs 4.83±0.80(p<0.05)；87.60±11.89 vs47.10±9.02(p<0.01)]。15d-PGJ<,2>治療組明顯延緩蛋白尿的發(fā)生，血尿素氮、肌酐明顯降低[5.64±0.99 vs 8.04±2.11(p<0.05)；58.53±13.35 vs87.60±11.89(p<0.05)]。腎臟病理光鏡下顯示：模型組12周時系膜細(xì)胞中至重度

12、增生，內(nèi)皮下大量嗜復(fù)紅物質(zhì)沉積，部分腎小球有白金耳樣改變，球囊粘連，局灶或節(jié)段腎小球硬化，腎小管蛋白管型和腎間質(zhì)大量炎細(xì)胞浸潤，小球病變指數(shù)及小管間質(zhì)損傷指數(shù)較正常對照組均明顯加重；免疫熒光顯示腎小球系膜區(qū)及內(nèi)皮下大量免疫復(fù)合物沉積。與模型組比較，15d-PGJ<,2>治療組系膜細(xì)胞增生、腎小管損害及間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤顯著減輕，免疫熒光顯示腎小球局部復(fù)合物沉積無明顯變化。 正常對照組PPAR γ主要表達(dá)在近端腎小管上皮細(xì)胞、內(nèi)髓集合

13、管上皮細(xì)胞，主要定位于細(xì)胞核；模型組腎臟局部浸潤細(xì)胞、近曲小管、集合管、遠(yuǎn)曲小管胞漿及胞核均有表達(dá)，但PPAR γ mRAN及蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.01)。15d-PGJ<,2>治療組PPAR γ表達(dá)主要定位于各段腎小管上皮細(xì)胞核；腎組織PPAR γ mRNA及蛋白表達(dá)較模型組顯著上調(diào)(p<0.01)； 正常對照組腎組織僅部分髓質(zhì)腎小管上皮細(xì)胞膜表達(dá)CD40，腎小球無明顯的表達(dá)；模型組隨著病變進(jìn)展，CD40表達(dá)顯著增加，除

14、腎小管及間質(zhì)浸潤細(xì)胞CD40表達(dá)明顯增強(qiáng)外，部分腎小球內(nèi)亦有表達(dá)。與正常對照組相比，模型組CD40mRNA表達(dá)顯著升高：15d-PGJ<,2>治療組CD40表達(dá)模式部位與對照組比較無明顯改變，但CD40mRNA表達(dá)水平較模型組顯著降低。模型組脾細(xì)胞CD40陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著升高；15d-PGJ<,2>治療組脾細(xì)胞CD40的表達(dá)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與模型組對比顯著下調(diào)。 結(jié)論：cGVHD狼瘡樣小鼠模型中，PPAR γ表達(dá)在基因和蛋白水平

15、均顯著下調(diào)，且與腎臟病理改變負(fù)相關(guān)；15d-PGJ<,2>可顯著改善cGVHD狼瘡樣小鼠腎臟功能及腎臟病理，這種保護(hù)作用可能通過激活PPAR γ信號，抑制腎臟及脾臟CD40表達(dá)，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。 綜上所述，得出以下結(jié)論： 1. 狼瘡腎炎患者腎活檢組織PPAR γ高表達(dá)，并且與腎臟病理改變活動相關(guān)，提示PPAR γ信號異常參與狼瘡腎炎的發(fā)生和發(fā)展； 2.15d-PGJ<,2>通過激活PPAR γ途徑影響

16、近端腎小管上皮細(xì)胞共刺激信號CD40/CD40L和炎癥因子RANTES的表達(dá)和功能，激活PPAR γ是15d-PGJ<,2>發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用機(jī)制之一； 3.cGVHD小鼠腎組織PPARγ的表達(dá)異常，不能有效進(jìn)行炎癥反應(yīng)負(fù)反饋調(diào)節(jié)，參與LN的發(fā)生和發(fā)展；15d-PGJ<,2>可顯著改善cGVHD狼瘡樣小鼠腎臟功能及腎臟病理；提示PPAR γ作為治療靶點(diǎn)之一，在緩解LN病變進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。 4.PPAR γ表達(dá)在人