運用蛋白質(zhì)組學技術研究BCR-ABL融合蛋白對DNA損傷修復蛋白質(zhì)的影響.pdf

1、慢性粒細胞白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）的發(fā)生是由于t（9；22）（q34；q11）易位所致的bcr/abl融合基因，編碼產(chǎn)生了具有強烈酪氨酸激酶活性的BCR/ABL融合蛋白，該融合蛋白激活多條信號轉導通路、導致一系列蛋白質(zhì)的表達異常，誘發(fā)細胞惡性轉化。盡管其具體分子機制仍然有待闡明，但越來越多的證據(jù)顯示細胞DNA損傷修復功能的失常在CML發(fā)生發(fā)展以及耐藥性表型中起重要作用。 有鑒于此，我們選

2、擇以DNA的損傷修復功能為切入點，運用比較蛋白質(zhì)組學對比分析BCR/ABLp210轉化細胞株與對照細胞株在經(jīng)DNA損傷后的細胞蛋白質(zhì)組表達差異，為從整體角度探討B(tài)CR/ABL融合蛋白對DNA損傷修復功能的影響提供蛋白質(zhì)水平變化的信息。實驗分三個部分進行研究，主要方法、結果及結論如下： 1.穩(wěn)定表達BCR/ABL融合蛋白的小鼠BaF3-P210細胞株的建立及其生物學特性的研究 將含有bcr/abl基因的逆轉錄病毒載體轉染到

3、包裝細胞，收集病毒感染小鼠BaF3細胞，經(jīng)篩選和亞克隆，獲得穩(wěn)定表達BCR/ABL融合蛋白的BaF3-P210轉化細胞；用PCR、DNA測序、RT-PCR和Westernblot檢測bcr/abl基因在BaF3-P210細胞中的整合和表達；用臺盼藍細胞計數(shù)法、流式細胞儀（FCM）和MTT法研究BCR/ABL融合蛋白對BaF3細胞生物學特性的影響。 結果發(fā)現(xiàn)：bcr/abl基因整合在BaF3細胞基因組中，BaF3-P210細胞能穩(wěn)

4、定表達bcr/abl基因及其蛋白。與對照組相比，BaF3-P210細胞增殖速度增快（P<0.05）；G0/G1期細胞比例下降，S期和G2/M期細胞比例增高（P<0.05）；經(jīng)ST1571處理后的細胞增殖抑制率為（54.08±1.90）％（P<0.05），早期凋亡率為（12.35±2.04）％（P<0.05）。 2.BaF3-P210細胞和對照BaF3-MIGR1細胞DNA損傷模型的建立及其修復的動態(tài)觀測 選擇過氧化氫（H

5、2O2）為細胞DNA損傷的處理因素，采用彗星實驗檢測不同濃度H2O2誘導的BaF3-P210細胞和空載體感染細胞BaF3-MIGR1的DNA損傷以建立DNA損傷模型；繼而用彗星實驗對兩組細胞在DNA損傷后的修復情況進行不同時間段的動態(tài)觀測。實驗發(fā)現(xiàn)，BaF3-MIGR1細胞和BaF3-P210細胞DNA損傷模型的建立條件是：均采用50μmol/L終濃度的H2O2進行染毒，H2O2作用溫度和時間為4℃，10 min。而BaF3-P210細

6、胞與BaF3-MIGR1細胞相比DNA損傷后修復時間縮短，在損傷后60 min即可達到完全修復，而后者在損傷后120 min才能完全修復（P<0.05）。 3.BaF3-P210細胞與對照BaF3-MIGR1細胞在經(jīng)H2P2誘導DNA損傷后的比較蛋白質(zhì)組學分析 采用雙向凝膠電泳技術對各樣品組全細胞蛋白進行分離，通過優(yōu)化條件參數(shù)來確定合適的樣品上樣量和聚焦時間。用PDquest（7.0）軟件對掃描的二維凝膠電泳圖像進行分析

7、，篩選出BaF3-P210細胞與BaF3-MIGR1空載體感染對照細胞在經(jīng)H2O2誘導DNA損傷后的差異表達蛋白斑點。候選差異表達蛋白斑點經(jīng)膠內(nèi)胰酶酶解，MALDI-TOF-MS分析，得到肽指紋圖譜（peptide mass fingerprinting，PMF），使用Mascot軟件在SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫中檢索鑒定差異表達蛋白質(zhì)，并對差異蛋白質(zhì)進行生物信息學分析。 結果發(fā)現(xiàn)：通過優(yōu)化條件，最終確定合適的樣品上樣量為150

8、μg、最佳聚焦時間為70，000總伏特小時。通過對BaF3-P210細胞與BaF3-MIGR1細胞分別經(jīng)H2O2處理后細胞組的二維凝膠電泳圖像進行對比分析，發(fā)現(xiàn)約有41個蛋白斑點表達有差異，其中29個蛋白表達上調(diào)，12個蛋白表達下調(diào)。對其中35個差異蛋白斑點進行MALDI-TOF-MS分析后，鑒定出了13種可能的差異表達蛋白。 通過以上實驗可以得出如下結論： 1.通過逆轉錄病毒載體基因轉移技術成功構建了能穩(wěn)定表達BCR/

9、ABL融合蛋白的小鼠BaF3-P210轉化細胞株；該細胞株具有增殖能力增強、細胞周期進程加速和對STI571敏感的惡性表型特征。 2.進一步通過彗星實驗建立了BaF3-P210細胞和BaF3-MIGR1細胞的DNA損傷模型，并發(fā)現(xiàn)BCR/ABL融合蛋白可增強BaF3-P210細胞的DNA損傷后修復能力。 3.運用比較蛋白質(zhì)組學技術研究發(fā)現(xiàn)，兩組細胞經(jīng)H2O2處理后，BaF3-P210細胞內(nèi)發(fā)生了廣泛而復雜的蛋白表達的改變

10、。鑒定出的13個差異蛋白質(zhì)分別涉及到了DNA損傷修復相關的蛋白、細胞周期調(diào)控相關蛋白、細胞凋亡相關蛋白、細胞增殖相關蛋白、細胞能量代謝相關蛋白、信號轉導相關蛋白等。 綜上所述，本研究以小鼠BaF3-P210轉化細胞株為模型，選擇H2O2為細胞DNA損傷的處理因素，運用比較蛋白質(zhì)組學技術篩選到了若干受BCR/ABL融合蛋白影響的包括DNA損傷修復相關蛋白在內(nèi)的差異蛋白，為進一步闡明受BCR/ABL融合蛋白調(diào)控的信號轉導途徑及探討B(tài)