聚合酶δ及其相關(guān)蛋白DNA損傷響應(yīng)機制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、DNA在細胞內(nèi)外各種因素的作用下可不斷產(chǎn)生損傷，如體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生的自由基和其它活性化合物，DNA在復(fù)制和重組過程中自發(fā)的錯誤;環(huán)境中的紫外線和離子輻射以及一些化學(xué)物質(zhì)均能損傷DNA。哺乳動物通過主動防御機制來應(yīng)對這些DNA損傷，被稱為DNA損傷應(yīng)答(DDR)。這一機制通過募集或裝備一系列與修復(fù)相關(guān)的蛋白復(fù)合物并激活DNA修復(fù)系統(tǒng)，激活細胞周期檢查點甚至細胞凋亡等程序來應(yīng)對DNA損傷。而在這些過程中需要各種各樣的蛋白參與其中，其中也包

2、括DNA聚合酶Polδ。
　　 DNA聚合酶δ是p125，p68，p50，p12四個亞基構(gòu)成的異源四聚體，屬于DNA聚合酶B家族，具有5'-3'聚合酶催化活性和3'-5'核酸外切酶活性。最新的研究發(fā)現(xiàn)它不僅是染色體DNA復(fù)制過程中最主要的復(fù)制酶，還參與多種形式的損傷修復(fù)。真核生物體內(nèi)常見的一些修復(fù)途徑如錯配修復(fù)、跨損傷合成，堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、雙鏈斷裂修復(fù)等過程中均涉及Polδ，而且Polδ本身也可能是一個DNA損傷響

3、應(yīng)的靶目標(biāo)，它通過p12的降解由四聚體形式轉(zhuǎn)換成三聚體形式應(yīng)對DNA損傷。目前，對Polδ參與DNA損傷響應(yīng)的研究已經(jīng)取得了長遠的進步，但是對Polδ及其相關(guān)蛋白參與DNA損傷響應(yīng)的機制還完全不了解，因此本研究以HeLa細胞為材料，通過分別加入三種DNA損傷處理劑(HU，MMS，Aphidicolin)對細胞進行損傷，并進行WesternBlot驗證;之后運用二維電泳技術(shù)分離并鑒定HU處理8小時前后HeLa細胞蛋白表達譜變化;最后對差異

4、蛋白進行Go分析和KEGGPathway分析，得到的結(jié)果如下:
　　 1.在損傷形成后，p12均會逐漸降解，其中在HU和MMS處理后，Chk-1會被磷酸化，從而激活A(yù)TR/Chk1信號通路。而機體對損傷進行修復(fù)后，p12又重新回復(fù)。
　　 2.二維電泳后由PDquest軟件分析出的差異蛋白經(jīng)MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定。最終得到35個表達變化蛋白，其中表達上調(diào)蛋白17個，下調(diào)蛋白18個。
　　 3.對差異蛋

5、白的Go分析發(fā)現(xiàn)，在細胞定位方面，在處理前后的差異蛋白主要集中在胞內(nèi)區(qū)域;在分子功能方面，處理前后的差異蛋白主要具有綁定和催化的功能;差異蛋白參與最多的是分子過程和代謝過程。而KEGGpathway分析表明:表達水平升高的蛋白，主要參與HumanDiseases通路，表達下調(diào)的蛋白主要參與metabolism和GeneticInformationProcessing通路。
　　 通過二維電泳揭示DNA聚合酶Polδ及其相關(guān)蛋白D