缺血后處理減輕大鼠全腦缺血-再灌注損傷的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、最近衛(wèi)生部公布我國城市和農(nóng)村地區(qū)腦血管病均已經(jīng)成為繼惡性腫瘤后的第二大死亡原因,隨著我國步入老齡化社會,腦血管病的發(fā)病率呈逐年增高的趨勢.其居高不下的致死率及致殘率給患者及親屬帶來極大的心理壓力,給家庭和社會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中急需攻克的難題. 快速恢復(fù)血液灌流是減小梗死面積和促進(jìn)功能恢復(fù)最有效的方法,因為及時恢復(fù)血液再灌注可以挽救部分可逆性損傷的神經(jīng)元,減輕腦缺血損傷.然而缺血后的血流恢復(fù)在某些情況下能導(dǎo)致進(jìn)一步的組織

2、損傷和功能障礙,因為ROS過量產(chǎn)生、鈣超載等通常發(fā)生在再灌注早期,這種恢復(fù)血流灌注后引起的進(jìn)一步損害稱為缺血一再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury). 缺血-再灌注損傷機(jī)制十分復(fù)雜,相互間構(gòu)成一個負(fù)反饋的級聯(lián)網(wǎng)絡(luò).多年來科學(xué)家試圖找到有效的藥物或干預(yù)措施來減輕缺血-再灌注損傷,雖然發(fā)現(xiàn)有些藥物或處理措施在實驗動物身上有效,但到目前為止能成功應(yīng)用于臨床的仍然很少.缺血后處理,即在缺血后給予幾個短暫的灌

3、注/再缺血循環(huán)的處理措施,首先在心臟的缺血一再灌注損傷中被證明有保護(hù)作用.因缺血后處理能在缺血后實施,且是通過激發(fā)機(jī)體內(nèi)在的保護(hù)機(jī)制,其潛在的臨床應(yīng)用前景引起了科研工作者的興趣. 最近研究表明缺血后處理也能對抗神經(jīng)組織的缺血-再灌注損傷:減小大鼠腦梗死的面積,改善兔脊髓缺血損傷后運動功能.腦組織對缺血缺氧尤為敏感,相當(dāng)多的臨床事件均會導(dǎo)致全腦缺血缺氧,因此在這些事件中大腦也是最容易損傷的部位,其中海馬和皮層神經(jīng)元損傷尤重.然而缺

4、血后處理是否能夠?qū)谷X缺血-再灌注損傷尚未見報道,闡明這一問題將可能給臨床帶來除藥物外另一有希望的治療選擇. 因此,本研究旨在探討缺血后處理在全腦缺血再灌注損傷中可能的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制. 研究內(nèi)容: 1、缺血再灌注7天后取腦,行HE染色,計數(shù)海馬CA1區(qū)每mill,皮層每mm<'2>存活細(xì)胞數(shù),觀察缺血后處理能否減少全腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元的死亡. 2、缺血再灌注7天后用Moms水迷宮評價其學(xué)習(xí)記

5、憶能力,觀察缺血再灌注損傷后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的減退程度,以及缺血后處理能否改善缺血后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力. 3、用激光多普勒血流監(jiān)測儀對比觀察每組大鼠缺血前、缺血中、缺血后處理中及完全再灌注后腦血流灌注的變化情況. 4、缺血再灌注6h,12h取腦行細(xì)胞色素C免疫組化染色,觀察缺血后處理對缺血再灌注后細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)的影響. 方法: 1、全腦缺血模型制作:應(yīng)用四血管結(jié)扎法(4-VO)制作全腦缺血

6、模型,第一天雙側(cè)頸總動脈下埋線備用,并凝閉雙側(cè)椎動脈,第二天用微型動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈,缺血10min. 2、缺血后處理方法:缺血后完全復(fù)灌之前再夾閉雙側(cè)頸總動脈施行三次短暫缺血. 3、實驗分組:整個實驗動物分為6組:①假手術(shù)組(Sham);②模型組(Control);③后處理組Ⅰ(Post-15/15):完全復(fù)灌前進(jìn)行15s/15s再灌注/缺血三個循環(huán);④后處理組Ⅱ(Post-30/30):完全復(fù)灌前進(jìn)行30s/30

7、s再灌注/缺血三個循環(huán);⑤后處理組Ⅲ(Post-60/15):完全復(fù)灌前進(jìn)行60s/15s再灌注/缺血三個循環(huán);⑥后處理組Ⅳ(Post-45-15/15):復(fù)灌Us后再進(jìn)行15s/15s再灌注/缺血三個循環(huán). 4、HE染色:經(jīng)左心室灌注固定、取腦石蠟包埋、制作海馬冠狀切片、常規(guī)HE染色,光鏡下計數(shù)海馬CAl區(qū)每mm,皮層每mm<'2>存活細(xì)胞數(shù)量. 5、行為學(xué)評價:缺血后一周在Moms水迷宮中訓(xùn)練大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,記錄

8、其游泳軌跡并用軟件分析training trail中潛伏期、游泳路程和游泳速度,probe test中大鼠在原平臺象限的游泳時間. 6、腦血流灌注量的測定:凝閉椎動脈手術(shù)過程中安裝探頭座,用激光多普勒血流監(jiān)測儀記錄缺血前、缺血中、缺血后處理中及完全再灌注后腦血流灌注量. 7、免疫組化染色:經(jīng)左心室灌注固定、取腦石蠟包埋、制作海馬冠狀切片、切片脫臘,熱修復(fù)抗原,行細(xì)胞色素C免疫組化染色,光鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)每mm,皮層每

9、min<'2>細(xì)胞色素C免疫陽性細(xì)胞數(shù)量. 結(jié)果: 1、缺血后處理對全腦缺血-再灌注損傷后神經(jīng)元死亡的影響缺血后立即給予15s/15s、30s/30s或再灌注45s后再給予15s/15s再灌,缺血三個循環(huán)的處理(Post-15/15,Post-30/30,P0st-45-15/15)均能顯著增加再灌注7天或3周后大鼠海馬和皮層存活神經(jīng)元數(shù)量,而60s/15s再灌,缺血三個循環(huán)(Post-60/15)的處理沒有觀察到保護(hù)作

10、用. 2、缺血后處理對全腦缺血-再灌注損傷后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響模型組和Post-60/15組大鼠與假手術(shù)組大鼠相比其學(xué)習(xí)記憶能力顯著降低,后處理組(Post-15/15,P0st-30/30,Post-45-15/15)大鼠相比于模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力又有顯著提高. 3、缺血后處理對缺血后腦血流灌注量的影響缺血后恢復(fù)血液灌流所有大鼠均能觀察到一段時間的超灌注期,其后又有一段時間的低灌注期,Post-15/15,Pos

11、t-30/30,Post-45-15/15等三種后處理方式均能顯著減少超灌注期的灌注量并縮短超灌注期的持續(xù)時間,增加低灌注期的灌注量. 4、缺血后處理對細(xì)胞色素C釋放的影響缺血10min再灌注6h或12h后海馬CAl區(qū)和頂皮層細(xì)胞色素C免疫陽性神經(jīng)元顯著增加,Post-15/15,Post-30/30處理方式均能顯著抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì),而Post-60/15組細(xì)胞色素C免疫陽性神經(jīng)元與模型組相比無顯著差異.