缺血后處理對老年大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其機制的研究.pdf

1、研究背景:
　　WHO《世界衛(wèi)生統(tǒng)計2008》報告：在未來的二十年，隨著中低收入國家人群進入老齡化，非傳染性疾病的死亡率將會大幅度增長。從全球范圍看，預(yù)計到2030年，死于心血管疾病的人數(shù)將從2004年的1710萬增加到2340萬。
　　冠心病(coronary heart disease,CHD)是人類死亡的主要原因之一，每年有約380萬男性和340萬女性死于冠心病。發(fā)生急性心肌梗死(acute myocardial in

2、farction,AMI)后，盡早進行有效的心肌再灌注，無論是使用溶栓治療、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI),還是急診冠脈搭橋(coronary artery bypass grafting,CABG)治療都是最有效的減小心肌梗死面積和改善臨床預(yù)后的策略。然而，缺血心肌恢復(fù)血流灌注的過程中，可以誘導(dǎo)損傷，這種現(xiàn)象，稱為心肌缺血再灌注損傷，可以減少心肌再灌注產(chǎn)生的有利影響

3、。這種形式的損傷，可以使那些在再灌注前即刻仍然存活的心肌細胞在再灌注后很快死亡。這種形式的心肌損傷本身可以誘導(dǎo)心肌細胞死亡和增加心肌梗死面積，或許可以部分解釋為什么盡管給予最適的心肌再灌注治療，AMI后死亡率仍然接近10％，AMI后心力衰竭的發(fā)病率仍然接近25％。AMI動物模型研究表明，最終的梗死面積，其中50％是致命的再灌注損傷引起的；這些實驗?zāi)Ｐ椭?，許多治療方法都顯示出能夠改善致命的再灌注損傷。然而，將這些能夠改善再灌注損傷的實驗方

4、法運用到臨床的時候，結(jié)果卻令人非常失望。雖然如此，但是在2003年，趙志青教授等報告在體犬心局部缺血45min后，再灌注開始早期給予三個循環(huán)的30s心肌缺血/30s心肌再灌注，可明顯減小犬心肌梗死面積。并將這種心臟保護作用命名為缺血后處理(ischemic postconditioning IPost)。之后不久，Staat和Laskey分別在臨床上進行PCI的AMI患者身上進行IPost，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IPost能夠減小心肌梗死面積達36％

5、以及促進心肌再灌注。
　　雖然IPost誘導(dǎo)產(chǎn)生心臟保護作用的確切機制仍然沒有完全清楚，但是發(fā)現(xiàn)可能是通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少細胞內(nèi)Ca2+超載，改善血管內(nèi)皮功能，減少凋亡心肌細胞的死亡，減少中性粒細胞積累以及延遲中性pH的恢復(fù)。此外，發(fā)現(xiàn)IPost激活再灌注損傷補救激酶(reperfusion injury salvage kinase,RISK)途徑，包括磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-k

6、inase,PI3-K)-蛋白激酶B(Akt)途徑和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulating kinases,ERK)途徑。最近，一些研究發(fā)現(xiàn)糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3beta,GSK-3β)Ser9磷酸化能促進心肌對缺血再灌注損傷的耐受。
　　IPost保護心肌缺血再灌注損傷的大多數(shù)研究都是在成年鼠類離體心臟上進行的，并發(fā)現(xiàn)心臟保護信號及促細

7、胞生存機制可能涉及PI3-K/Akt,ERK1/2以及GSK-3β等。最近有一些研究發(fā)現(xiàn)IPost未能保護老年小鼠心臟。但是關(guān)于IPost的保護作用能否在老年大鼠或人身上獲得及相關(guān)機制還是知之甚少。
　　研究目的:
　　(1)確定成年大鼠在體心臟急性缺血后再灌注即刻給予缺血后處理能否保護心臟，減輕缺血再灌注損傷。
　　(2)評價缺血后處理能否減輕老年大鼠在體心臟缺血再灌注后的損傷，并比較后處理保護作用在成年大鼠與老年大

8、鼠之間的區(qū)別。
　　(3)初步確定老年大鼠缺血后處理的保護作用是否與心肌細胞內(nèi)PI3-K/Akt及GSK-3β的磷酸化有關(guān)，如果有關(guān)，則激活PI3-K/Akt和GSK-3β可能是治療缺血再灌注損傷的新的治療手段。
　　實驗方法:
　　1．成年（3-4個月）及老年（16-18個月）雄性SD大鼠，戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔麻醉后，行左側(cè)開胸術(shù)，6-0絲線穿過左冠狀動脈前降支（LAD），制備心肌缺血/再灌注大鼠模型。大

9、鼠心臟缺血30min，再灌注3h。
　　2．針形電極置于大鼠四肢皮下，連續(xù)記錄心電圖（electrocardiogram,ECG）。自右側(cè)頸動脈插管至左心室，記錄血流動力學(xué)參數(shù)。左側(cè)頸外靜脈插管給藥。
　　3．實驗共分為10組，成年及老年大鼠各5組（n=8/成年組，n=6/老年組）。①成年大鼠缺血再灌注組（I/Radult)及老年大鼠缺血再灌注組（I/Raged）：大鼠造模，缺血前后及再灌注前后不再給予其他干預(yù)；②成年大鼠缺

10、血后處理組（IPostadult）及老年大鼠缺血后處理組（IPostaged）：大鼠造模，再灌注即刻給予缺血后處理（4×10sI/10sR），再無其他干預(yù)；③成年大鼠缺血后處理聯(lián)合LY294002組（IPost+LYadult）及老年大鼠缺血后處理聯(lián)合LY294002組（IPost+LYaged）：LY294002是選擇性的PI3K抑制劑，大鼠造模，再灌注即刻給予缺血后處理（4×10sI/10sR），同時由另一術(shù)者經(jīng)大鼠左側(cè)頸外靜脈給藥

11、LY294002（0.3mg/kg），再無其他干預(yù)；④成年大鼠藥物載體組（Vehicleadult）及老年大鼠藥物載體組（Vehicleaged）：大鼠造模，再灌注即刻給予缺血后處理，同時給予0.02％的DMSO（與IPost+LY組等容積，而不含有LY294002）；⑤成年大鼠假手術(shù)組(Shamadult)及老年大鼠假手術(shù)組（Shamaged）：未造模大鼠，頸部切開，氣管插管，開胸，前降支下縫線等過程均同造模組，只是不進行冠脈結(jié)扎。<

12、br>　　4．在缺血前及再灌注3h后取血0.5mL，離心，取血清-70℃保存，用血清肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒檢測酶活性。
　　5．再灌注結(jié)束時，采用Evans blue與TTC染色測量缺血區(qū)及梗死區(qū)面積。
　　6．上述10組，各組均額外再做4只大鼠，缺血30min，在再灌注15min時，取缺血區(qū)組織，采用Western Blotting方法測定缺血心肌組織Akt，GSK-3β蛋白含量及其磷酸化水平。

13、>　　實驗結(jié)果:
　　1．血流動力學(xué)參數(shù)包括心率(HR)、LVDP以及±dP/dtmax
　　(1)心率：在所有監(jiān)測的時間點I/Radult，IPostadult及IPost+LYadult組之間；I/Raged，IPostaged及IPost+LYaged組之間沒有顯著差異。單就I/R組而言，在基線、I5min，R15min及R30min時老年大鼠的心率明顯低于成年大鼠組。就IPost及IPost＋LY組而言，老年大鼠與成

14、年大鼠心率沒有差異。
　　(2)LVDP：所有監(jiān)測的時間點I/Radult，IPostadult及IPost+LYadult組之間；I/Raged，IPostaged及IPost+LYaged組之間沒有顯著差異。單就I/R組而言，基線、R5min，R1h及R2h時老年大鼠的LVDP明顯低于成年大鼠組。就IPost組而言，R5min和R2h時老年大鼠的LVDP明顯低于成年大鼠組。就IPost＋LY組而言，R2h和R3h時老年大鼠的L

15、VDP明顯低于成年大鼠組。
　　(3)+dP/dtmax:R5min，R2h及R3h，IPostadult組大鼠+dP/dtmax明顯高于I/Radult及IPost+LYadult。但在所有監(jiān)測的時間I/Raged，IPostaged及IPost+LYaged組之間沒有顯著差異。單就I/R組而言，老年大鼠與成年大鼠之間沒有差別。就IPost組而言，整個再灌注期間除了R1h時，老年大鼠的+dP/dtmax明顯低于成年大鼠。就IPo

16、st＋LY組而言，只是在R30min時老年大鼠的+dP/dtmax明顯低于成年大鼠組。
　　(4)-dP/dtmax:R2h及R3h，IPostadult組大鼠-dP/dtmax明顯高于I/Radult及IPost+LYadult。但在所有監(jiān)測的時間I/Raged，IPostaged及IPost+LYaged組之間沒有顯著差異。在I/R組和IPost＋LY組，只有I5min時，老年大鼠的-dP/dtmax明顯高于成年大鼠。但在IP

17、ost組，R5min和R15min時，老年大鼠的-dP/dtmax都明顯低于成年大鼠組。
　　2．冠脈LAD阻塞后缺血危險區(qū)（areaatrisk,AAR?以％LV表示）在除Sham組外的其余各組之間是可比的（I/Radult，52.8±5.2％；IPostadult，52.0±5.0％；IPost+LYadult，52.2±5.8％；I/Raged,51.3±7.2％；IPostaged，53.8±3.5％；IPost+LYag

18、ed，51.1±5.8％；所有P=NS）。正如所期望的，與I/R組相比，IPost明顯減小梗死面積（Infarctsize，IS；以％AAR表示）（IPostadultvs.I/Radult：11.9±1.6％vs.30.2±2.8％，P＜0.05；IPostagedvs.I/Raged：13.7±2.5％vs.27.5±3.5％，P＜0.05）。再灌注同時給予PI3K抑制劑LY294002，結(jié)果取消IPost的減小IS的作用（IPos

19、t+LYadultvs.IPostadult：30.1±2.9％vs.11.9±1.6％，P＜0.05；IPost+LYagedvs.IPostaged：33.4±7.0％vs.13.7±2.5％，P＜0.05）。而在I/Radult組與I/Raged組、IPostadult組與IPostaged組、IPost+LYadult組與IPost+LYaged組IS之間均無統(tǒng)計學(xué)差異（所有P=NS）。
　　3．在術(shù)前，老年組血清CK的水

20、平均明顯低于成年組，LDH水平老年與成年組之間均無差異。術(shù)前，CK與LDH水平在老年組內(nèi)部及成年組內(nèi)部各組間也無差異。與術(shù)前相比，再灌注3h后各組CK及LDH水平顯著升高（所有P<0.05）。再灌注3h后IPost組CK與LDH水平升高幅度均顯著低于I/R組（所有P<0.05）。給予PI3K抑制劑LY294002后，CK與LDH水平升高幅度均比IPost組高（所有P<0.05），但與I/R組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　4．任兩組間總A

21、kt（t-Akt）與總GSK-3β（t-GSK-3β）水平無差異。但是不論是成年組大鼠還是老年組，與I/R組相比，IPost均顯著增加p-Akt水平（p-Akt/t-Akt:IPostadultvs.I/Radult:0.64±0.04vs.0.40±0.09，P＜0.05；IPostagedvs.I/Raged：0.63±0.03vs.0.39±0.01,P＜0.05）。給予LY294002后可阻斷Akt磷酸化（p-Akt/t-Akt

22、：IPost+LYadultvs.IPostadult:0.34±0.07vs.0.64±0.04，P＜0.05；IPost+LYagedvs.IPostaged：0.35±0.09vs0.63±0.03，P＜0.05）。同樣，IPost也明顯增加GSK-3β磷酸化水平，而LY294002則阻斷GSK-3β的磷酸化。
　　結(jié)論:
　　1．再灌注即刻給予缺血后處理能夠減小成年SD大鼠心肌梗死面積，降低CK及LDH升高水平，并能