骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠脊髓損傷及其體外向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脊髓損傷（spinalcordinjury，SCI）是一種嚴(yán)重威脅人類生命和健康的常見疾病。近年來，由交通事故、高處墜落和運(yùn)動損傷等因素導(dǎo)致的SCI患者數(shù)量日漸增多，多發(fā)生于青壯年人群中。大部分患者因SCI而導(dǎo)致身體的終生殘疾，給社會和家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前人類還沒有找到針對SCI治療的行之有效的方法，現(xiàn)階段在臨床上常用的方法是在損傷后早期靜脈使用甲基強(qiáng)的松龍和外科手術(shù)治療，但是治療效果不佳。因此，尋找針對SCI有效的治療方法，確

2、實(shí)能夠在SCI后可以有效的減輕患者脊髓損傷程度，甚至促進(jìn)損傷神經(jīng)軸突的再生，重建脊髓的功能，一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年來隨著組織工程技術(shù)研究的興起和對SCI后的病理改變、機(jī)理認(rèn)識不斷深入的基礎(chǔ)上，科學(xué)家們提出采用組織工程技術(shù)治療脊髓損傷的思路，為脊髓損傷后的救治提供了新的方法。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）是骨髓造血系統(tǒng)中的非造血干細(xì)胞，具有容易獲取、體外增殖快和具有多向分化潛能

3、的特點(diǎn)，成為組織工程研究領(lǐng)域的種子細(xì)胞之一。
　　本實(shí)驗(yàn)研究包括：1.在成年大鼠脊髓損傷區(qū)內(nèi)移植BMSCs，觀察BMSCs對脊髓損傷區(qū)神經(jīng)纖維的保護(hù)和再生修復(fù)促進(jìn)作用。2.體外觀察嗅鞘細(xì)胞條件培養(yǎng)液對BMSCs的誘導(dǎo)分化作用。
　　實(shí)驗(yàn)一，BMSCs在骨髓造血過程中為血細(xì)胞的生成和分化提供適宜的微環(huán)境。研究表明BMSCs在體外培養(yǎng)過程中，具有很強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能，在體外特定的誘導(dǎo)條件下不僅可以分化為骨、軟骨和韌帶等多

4、種細(xì)胞，也可以向神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞分化。此外，BMSCs在生長和增殖過程中可以分泌一些營養(yǎng)因子，如腦源性神經(jīng)生長因子（BDNF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等。SCI后脊髓損傷區(qū)將出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞凋亡壞死，損傷區(qū)囊性空洞形成等一系列復(fù)雜的病理生理變化。因此我們嘗試?yán)肂MSCs的生物學(xué)特性，移植入損傷區(qū)內(nèi)，替代脊髓壞死凋亡的細(xì)胞，來達(dá)到對損傷區(qū)脊髓神經(jīng)纖維的保護(hù)和再生修復(fù)促進(jìn)作用。
　　采用細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法獲得同種異體BMSCs，

5、Hoechst標(biāo)記后，采用微量注射器移植入脊髓擠壓損傷大鼠的損傷間隙內(nèi)。于2、4周后取材制作切片，HE和免疫組織化學(xué)染色，采用BBB評分觀察運(yùn)動功能恢復(fù)情況。結(jié)果證實(shí)：BMSCs可以在脊髓損傷區(qū)間內(nèi)存活、遷移和向神經(jīng)細(xì)胞分化，能夠有效的阻止脊髓損傷囊性空洞的形成，對SCI后損傷區(qū)神經(jīng)纖維有保護(hù)作用，甚至可以促進(jìn)神經(jīng)纖維的再生和修復(fù)，但BBB評分結(jié)果各組之間在各時(shí)間點(diǎn)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。因此認(rèn)為BMSCs可以參與大鼠脊髓損傷后的修復(fù)重建過程，

6、但還不足以促進(jìn)其運(yùn)動功能恢復(fù)。
　　實(shí)驗(yàn)二，嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞（olfactory ensheathing cells，OECs）是一種僅存在于嗅神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞，能終生產(chǎn)生維持神經(jīng)元存活和軸突延長的神經(jīng)營養(yǎng)因子及神經(jīng)軸突促進(jìn)因子，包括NGF、BDNF、GDNF等多種神經(jīng)營養(yǎng)因子和一些表面粘附分子。而研究證實(shí)BMSCs具有多向分化潛能，因此，我們嘗試?yán)肙ECs在培養(yǎng)過程中分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子和表面粘附分子，來誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化，

7、為接下來研究誘導(dǎo)后的BMSCs與僅純化的BMSCs移植，在SCI損傷修復(fù)中有無差異提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。
　　選擇生長狀態(tài)良好的OECs，取其培養(yǎng)液，無菌條件下離心后，收集上清液即為OECs條件培養(yǎng)液。將已純化傳代培養(yǎng)第3代的BMSCs，按103～104/cm2接種于24孔培養(yǎng)板中，分為兩組：A組為條件培養(yǎng)組，加入OECs條件培養(yǎng)液共培養(yǎng)，B組為空白對照組，加入原BMSCs培養(yǎng)液。誘導(dǎo)后觀察BMSCs的形態(tài)學(xué)變化和免疫組織化學(xué)染色鑒定

8、。結(jié)果A組BMSCs在誘導(dǎo)后出現(xiàn)胞體縮小，可見突起出芽生長，突起細(xì)長。B組細(xì)胞仍呈長梭形，無明顯形態(tài)學(xué)變化。免疫組織化學(xué)染色A組呈神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物陽性，MAP-2和GFAP陽性細(xì)胞的比率分別為55.2％和23.4％。因此證實(shí)嗅鞘細(xì)胞條件培養(yǎng)液可以誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞分化。
　　本實(shí)驗(yàn)成功的獲得了大鼠的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，將其應(yīng)用于大鼠脊髓擠壓損傷的基礎(chǔ)治療研究和體外向神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究。成功的觀察到BMSCs，在大鼠