同種異體神經(jīng)復(fù)合體橋接修復(fù)兔坐骨神經(jīng)缺損促進(jìn)神經(jīng)-肌結(jié)構(gòu)重建和功能恢復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過制做坐骨神經(jīng)缺損模型，將種植雪旺細(xì)胞的去細(xì)胞同種異體神經(jīng)復(fù)合體移植橋接于坐骨神經(jīng)缺損斷端。觀察神經(jīng)-肌結(jié)構(gòu)重建和功能恢復(fù)過程。探討種植雪旺細(xì)胞的去細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植促進(jìn)神經(jīng)-肌結(jié)構(gòu)重建和功能恢復(fù)的作用和機(jī)制，從而為臨床上更加合理的治療周圍神經(jīng)缺損提供理論依據(jù)。 方法：1．細(xì)胞培養(yǎng)：取懷孕28天的新西蘭白兔，耳緣靜脈注入空氣處死后迅速取胎兔。在手術(shù)顯微鏡無菌條件取坐骨神經(jīng)，盡量去除神經(jīng)外膜及束膜。Hank’s液沖洗5遍

2、后將神經(jīng)剪碎。使用雙酶消化法(trypsin/collagenase)培養(yǎng)雪旺細(xì)胞，培養(yǎng)過程中利用雙差速貼壁法及Arab-C(終末濃度10<'-5>mmol/L)去除和抑制成纖維細(xì)胞后，使用NGF(40ng/ml)促進(jìn)SC細(xì)胞生長。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況并接種進(jìn)行傳代，收集生長良好的第二代細(xì)胞計(jì)數(shù)并應(yīng)用S-100蛋白免疫組化鑒定。2．去細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植物制備：取成年健康新西蘭白兔，分別于梨狀肌下緣水平以遠(yuǎn)切取雙側(cè)坐骨神經(jīng)

3、，作為異體神經(jīng)的來源。神經(jīng)萃取前先在手術(shù)顯微鏡下去除表面的脂肪組織及部分神經(jīng)外膜，置于4℃蒸餾水中靜置6h，再將神經(jīng)段放入3％Triton-X100溶液中靜置12h，然后置于蒸餾水中震蕩，漂洗6h。如此反復(fù)，Triton-X100共作用時(shí)間為96 h，4℃下保存，用于神經(jīng)移植。對(duì)萃取的神經(jīng)段行石蠟切片HE染色及掃描電鏡觀察去細(xì)胞的情況。3．種植雪旺細(xì)胞的同種異體神經(jīng)復(fù)合體修復(fù)兔坐骨神經(jīng)缺損促進(jìn)神經(jīng)-肌結(jié)構(gòu)重建與功能恢復(fù)的實(shí)驗(yàn)觀察：將培養(yǎng)

4、的第二代雪旺細(xì)胞以1×10<'8>/ml的濃度用100ul的微量注射器注射入去細(xì)胞神經(jīng)段內(nèi)，形成同種異體神經(jīng)復(fù)合體，然后將此復(fù)合體迅速移植到兔缺損的-側(cè)坐骨神經(jīng)(實(shí)驗(yàn)組)，對(duì)照組移植未注入雪旺氏細(xì)胞的去細(xì)胞同種異體神經(jīng)，術(shù)后4周，8周，16周大體觀察兔的足部潰瘍形成及愈合情況，肉眼觀察神經(jīng)愈合情況及靶肌肉形態(tài)變化。兩組動(dòng)物4，8，16周取材前行肌電圖檢查，取材后測量脛骨前肌濕重并行光鏡和透射電鏡觀察。肌電圖檢查橋接段坐骨神經(jīng)的潛伏期及傳

5、導(dǎo)速度：光鏡觀察橋接段遠(yuǎn)端的腓神經(jīng)的有髓纖維數(shù)目，髓鞘，軸索，結(jié)締組織及血管再生情況及所支配的脛骨前肌肌纖維和運(yùn)動(dòng)終板結(jié)構(gòu)形態(tài)改變：電鏡觀察神經(jīng)髓鞘，軸索，線粒體，微管，微絲，雪旺細(xì)胞等超微結(jié)構(gòu)的變化。 結(jié)果：1．雪旺細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察：經(jīng)傳代的雪旺細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)并觀察細(xì)胞形態(tài)：雪旺細(xì)胞的濃度已達(dá)到1×10<'8>/ml，其典型形態(tài)呈梭形，有突起，多為雙極，偶見三個(gè)細(xì)胞突起。胞核明顯，呈卵圓形。細(xì)胞呈端對(duì)端、肩并肩、漩

6、渦狀或柵欄樣排列生長。視野內(nèi)仍可見少量成纖維細(xì)胞，胞體較雪旺細(xì)胞大，扁平狀外形不規(guī)則，突起短而多，核仁明顯，有2-3個(gè)核仁，顏色較雪旺細(xì)胞淺。2．去細(xì)胞神經(jīng)橋接體的觀察：大體觀察：神經(jīng)萃取過程中可見兩端及周圍有絮狀物析出，萃取后神經(jīng)呈淡乳白色，無光澤，其外徑及長度較新鮮神經(jīng)稍減小，柔軟，有韌性。HE染色觀察：神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)消失，紅染的神經(jīng)內(nèi)膜呈波浪狀縱形排列，形成管柱狀空隙。掃描電鏡觀察：神經(jīng)內(nèi)的軸突、髓鞘己被完全去除，可見由膠原纖維構(gòu)成

7、的立體管狀結(jié)構(gòu)，部分管腔不規(guī)則。膠原纖維仍維持原有的位置、形態(tài)及結(jié)構(gòu)特征，管內(nèi)并可見膜樣結(jié)構(gòu)，為雪旺細(xì)胞基底膜。3．種植雪旺細(xì)胞的同種異體神經(jīng)復(fù)合體修復(fù)兔坐骨神經(jīng)缺損促進(jìn)神經(jīng)一肌結(jié)構(gòu)重建與功能恢復(fù)的實(shí)驗(yàn)觀察：術(shù)后4周、8周、16周兩組動(dòng)物手術(shù)區(qū)局部均未出現(xiàn)明顯的排斥反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)組足部潰瘍愈合情況、神經(jīng)纖維數(shù)目、髓鞘及再生神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)，運(yùn)動(dòng)終板的形態(tài)及靶肌肉結(jié)構(gòu)的恢復(fù)均優(yōu)于對(duì)照組。神經(jīng)傳導(dǎo)速度(NCV)于術(shù)后4周時(shí)，兩組均未見明顯的神經(jīng)傳

8、導(dǎo)，術(shù)后8周、16周實(shí)驗(yàn)組優(yōu)于對(duì)照組。脛骨前肌濕重于術(shù)后4周實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無明顯差異，術(shù)后8周、16周實(shí)驗(yàn)組恢復(fù)優(yōu)于對(duì)照組。 結(jié)論：1．采用雙酶消化法和雙差速貼壁法培養(yǎng)和提純雪旺細(xì)胞并輔以神經(jīng)生長因子(NGF)可獲取足夠濃度的雪旺細(xì)胞。2．用3％Triton X-100作用96小時(shí)后可去除周圍神經(jīng)中的細(xì)胞和髓鞘而保留完整的基底膜管和纖維支架結(jié)構(gòu)。3．種植雪旺細(xì)胞的去細(xì)胞同種異體神經(jīng)復(fù)合體不僅能夠能為再生神經(jīng)提供良好的支架作用，又