GFP轉(zhuǎn)染的骨髓來源神經(jīng)元樣細胞橋接修復坐骨神經(jīng)長距離缺損的研究.pdf

1、研究背景:
　　 周圍神經(jīng)損傷(PNI)是臨床常見的損傷。近年來,隨著現(xiàn)代交通事業(yè)以及工業(yè)建筑事業(yè)發(fā)展進程的不斷推進,PNI的發(fā)病率日益上升。在美國,臨床上每年有5萬甚至更多的周圍神經(jīng)缺損病例發(fā)生;我國周圍神經(jīng)損傷病例每年新增60萬-90萬例[1]。同時,相較于其它組織,神經(jīng)元在成熟生長階段不具備分裂和復制功能,發(fā)生損傷后,若不采取積極有效的措施進行救治,極易導致?lián)p傷處損害甚至喪失肌肉功能、感覺功能,進而造成終生殘疾[2]。不僅

2、對人們的生活質(zhì)量造成嚴重影響,同時也威脅著人們的身心健康。目前周圍神經(jīng)缺損的治療策略,是依據(jù)周圍神經(jīng)損傷再生的理論,通過提供一個神經(jīng)纖維再生通道、給予必要的支持細胞以及神經(jīng)生長因子等方法,促進神經(jīng)再生的,沒能解決神經(jīng)快速到達效應(yīng)器、感受器的問題。鑒于此,“橋接神經(jīng)元修復周圍神經(jīng)缺損”的設(shè)想被提出,即通過神經(jīng)元接力的方法,加快神經(jīng)到達效應(yīng)器、感受器的時間,減少效應(yīng)器、感受器病變程度,提高神經(jīng)損傷修復的效果。
　　 目的:
　

3、　 1、抽取家兔骨髓,進行培養(yǎng),選取家兔骨髓源性神經(jīng)組織定向干細胞(NTCSC)為種子細胞。并采用免疫熒光細胞化學鑒定方法對種子細胞進行鑒定,確定該細胞來源于神經(jīng)干細胞。
　　 2、NTCSC的分離和鑒定,培養(yǎng)后獲取第三代NTCSC。并對其進行攜帶GFP的慢病毒進行轉(zhuǎn)染,獲取攜帶GFP的NTCSC。
　　 3、誘導攜帶GFP的NTCSC向神經(jīng)元細胞分化,獲取滿足移植條件的干細胞源性神經(jīng)元細胞。
　　 4、制備脫

4、細胞神經(jīng)支架,構(gòu)建神經(jīng)再生室。
　　 5、在神經(jīng)支架上種植干細胞源性神經(jīng)元細胞,實現(xiàn)神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)移植體的體外構(gòu)建。
　　 6、實現(xiàn)神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)移植體的體外培養(yǎng),對支架內(nèi)細胞的變化規(guī)律、神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)的電生理特性等進行觀察。
　　 7、實現(xiàn)神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)移植體的在體研究,觀察GFP轉(zhuǎn)染的骨髓來源神經(jīng)元樣細胞在受損周圍神經(jīng)中的存活狀況,以及神經(jīng)元性組織工程神經(jīng)在修復受損周圍神經(jīng)中發(fā)

5、揮的效果。
　　 方法:
　　 1、選取3月齡家兔為材料對象,于其脛骨平臺下抽取2～3ml骨髓。培養(yǎng)骨髓神經(jīng)組織定向干細胞。以該骨髓神經(jīng)組織干細胞為種子細胞。
　　 2、骨髓神經(jīng)組織干細胞混合液進行離心、培養(yǎng),待細胞生長至80％融合,進行傳代,獲取第三代NTCSC。然后在第三代NTCSC混合中,滴加1.5×109pfu/L攜帶GFP基因慢病毒表達載體的病毒懸液10μL,對第三代NTCSC進行轉(zhuǎn)染,獲取,攜帶GFP

6、的NTCSC。
　　 3、在攜帶GFP的NTCSC培養(yǎng)基中分別加入誘導劑Soniehedgehog(Shh,500ng/mL)/Retino Acid(RA,2000nmol/L)即RA+SHH,誘導種子細胞向神經(jīng)元細胞方向分化。
　　 4、采用10 cm長的醫(yī)用硅膠管為神經(jīng)支架材料,將其放入-80℃冰箱中進行冷凍,待其干燥成形后,制成干燥成形的膠原-殼聚糖支架材料。然后,將兔坐骨神經(jīng)剪除長約0.5cm一段,使其自然回縮

7、,形成1.5cm缺損,并將無菌硅膠管縫接于神經(jīng)缺損處的兩斷端,制作成動物模型。
　　 5、制備實驗兔坐骨神經(jīng)1.5cm缺損模型20只及自體神經(jīng)移植模型10只。分別進行3組實驗。將實驗兔隨機分為3組,每組10只。
　　 實驗1組:(空支架移植組):將實驗兔坐骨神經(jīng)切除0.5cm,使其自然回縮,形成1.5cm長的缺損,將細胞支架與坐骨神經(jīng)兩斷端縫合,用微量注射器沿縱軸伸入其中,采用散點注射法將細胞懸液植入脫細胞神經(jīng)支架中,以

8、1.5mm的距離為沒點間距,共11個注射點,注入無細胞的細胞培養(yǎng)液160μL。
　　 實驗2組:(細胞支架組):將107細胞數(shù)/mL濃度的NTCSC源性神經(jīng)細胞懸液微量注射器抽取細胞懸液160μL,方法同上。
　　 實驗3組:(神經(jīng)移植組):將實驗兔坐骨神經(jīng)截斷約1.5cm,將近端與遠端調(diào)轉(zhuǎn)后縫合。
　　 對上述構(gòu)建的神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)移植體進行體外培養(yǎng),對支架內(nèi)細胞的變化規(guī)律、神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)的電生理

9、特性等進行觀察。
　　 6、在神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)移植體的體內(nèi)研究上,細胞移植4、8、12、16周時進行動物行為學觀測、肌力評估,肌電圖等檢測。觀察GFP轉(zhuǎn)染的骨髓來源神經(jīng)元樣細胞在受損周圍神經(jīng)中的存活狀況,研究“橋接神經(jīng)元修復周圍神經(jīng)缺損”的可行性,以及神經(jīng)元性組織工程神經(jīng)在修復受損周圍神經(jīng)中發(fā)揮的效果。
　　 結(jié)果:
　　 1、移植細胞在脫細胞神經(jīng)支架內(nèi)生長、分化實驗結(jié)果顯示:神經(jīng)元細胞組骨髓神經(jīng)組織定向干

10、細胞源性神經(jīng)細胞能夠成功的種植到支架上,且較為均勻的呈片狀分布,生長狀態(tài)良好。細胞膜光滑完整、胞漿豐富,核輪廓清晰。從而表明:在脫細胞神經(jīng)支架中實現(xiàn)骨髓神經(jīng)組織定向干細胞的移植,種子細胞能夠得到較好的定居、遷移和植入。且免疫組織化學檢測結(jié)果顯示:在脫細胞神經(jīng)支架上,Nestin陽性細胞實現(xiàn)了成功的種植,并可以在一定時間內(nèi)能夠保持自我更新和神經(jīng)前體細胞的穩(wěn)定性。同時,移植細胞在支架內(nèi)的電鏡觀察結(jié)果顯示:移植細胞在支架內(nèi)具有一定的功能結(jié)構(gòu)。

11、移植細胞在支架內(nèi)的電生理檢測結(jié)果:神經(jīng)元細胞組神經(jīng)移植體在體外培養(yǎng)8周時具有電生理特性?？傮w表明:移植細胞在脫細胞神經(jīng)支架內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)成功的移植,且生長、分化狀態(tài)良好。
　　 2、移植細胞在體內(nèi)生長的實驗結(jié)果顯示:實驗兔能夠具備較好的行走功能,肌肉收縮有力,神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)的傳導速度較快,實驗兔的肌肉蛋白質(zhì)含量較高,且HRP逆行示蹤實驗、免疫熒光組織化學檢測結(jié)果以及透射電鏡檢測結(jié)果均表明植入的NTCSC源性的神經(jīng)元可以在實驗