rhTrx-1對腦缺血后神經再生及認知功能障礙的影響.pdf

1、背景：
　　目前,腦中風治療的藥物和方法有限且效果欠佳。腦缺血可誘發(fā)海馬神經元丟失從而導致空間學習和記憶能力受損。雖然腦缺血后大腦中側腦室室下區(qū)和海馬齒狀回中神經干/祖細胞持續(xù)不斷的增殖,但是神經再生的作用仍存在爭議。腦缺血后新生的神經元可以向缺血部位發(fā)生遷移、分化、成熟后可整合入大腦回路中發(fā)揮作用,因此神經再生被認為是成年哺乳動物體內存在的一種內源性的修復機制,促進內源性神經再生治療缺血性中風為腦保護策略提供了新的干預靶點。

2、r>　　硫氧還蛋白(Thioredoxin,Trx)是一分子量為12kD的控制還原/氧化狀態(tài)和細胞增殖/生存的小分子蛋白質,通過其二硫醇-二硫化物的活性位點,參與機體細胞增殖、調節(jié)氧化還原狀態(tài)以及發(fā)揮抗凋亡作用等過程。因此,Trx系統(tǒng)被認為是除谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)系統(tǒng)之外的另一內源性抗氧化系統(tǒng)。哺乳動物機體內存在三種形式的Trx,胞質型 Trx-1、線粒體型 Trx-2以及精細胞中存在的一種Trx變體 SpTrx

3、/Trx3,其中 Trx-1是機體內的主要形式,當腦缺血發(fā)生時可以誘導內源性 Trx-1生成,減輕氧化損傷。作為一種抗氧化劑,在腦缺血模型中外源性給予人重組硫氧還蛋白(rhTrx-1)可以穿透血腦屏障發(fā)揮抗凋亡作用。除了其氧化還原酶的活性之外,近年來有研究發(fā)現(xiàn) rhTrx-1也可促進人體脂肪組織源性的間充質干細胞和血管生成。
　　因此我們推測,rhTrx-1可以通過促進海馬齒狀回神經干細胞再生,改善全腦缺血后空間學習和記憶能力下降

4、,產生腦保護作用。本實驗利用小鼠全腦缺血模型和海馬神經元離體培養(yǎng),運用行為學、免疫組織化學及 Western Blot等技術,對 rhTrx-1的促神經再生作用進行研究,探討其機制可能與 rhTrx-1可以促進神經干細胞增殖和向神經元方向分化作用有關,揭示 MEK/ERK信號通路可能參與了 rhTrx-1的促神經再生作用,初步構建了 rhTrx-1促神經再生作用與 MEK/ERK信號通路間的相互關系,為將 rhTrx-1應用于臨床治療腦

5、中風提供新的理論依據(jù)。
　　實驗一 rhTrx-1對小鼠全腦缺血后認知功能的影響
　　目的：探討 rhTrx-1對腦缺血小鼠學習和記憶能力的影響,為其機制研究奠定基礎。
　　方法：采用雙側頸總動脈夾閉方法,制作小鼠全腦缺血 BCCAO模型。1.8-12周齡SPF級雄性 C57BL/6J小鼠(18-22g),由第四軍醫(yī)大學動物實驗中心提供,隨機分為3組(n=5):假手術組(sham組)、缺血+溶劑組(CI+vehicle

6、組)、缺血+人重組硫氧還蛋白治療組(CI+rhTrx-1組),rhTrx-1及vehicle均在 BCCAO再灌前10min通過腹腔注射方式給予,于再灌注72h后行 Nissl染色,在高倍鏡下觀察海馬 CA1區(qū)神經元受損情況并對各組間存活的健康神經元數(shù)目進行計數(shù)。2.8-12周齡SPF級雄性 C57BL/6J小鼠(18-22g),隨機分為3組(n=8):sham組、CI+vehicle組、CI+rhTrx-1組,于再灌注后30d進行行為

7、學觀察,觀察指標為曠場實驗和Morris水迷宮測試。3.為排除麻醉藥物吸入過程可能會造成的低氧血癥或是高碳酸血癥的發(fā)生,單獨使用3組實驗動物(n=5):sham組、CI+vehicle組及CI+rhTrx-1組行左頸總動脈置管。每只小鼠分別在 BCCAO即刻和再灌注即刻自頸總動脈取血約0.2ml進行動脈血氣測定。
　　結果：1.血氣分析:結果顯示不同組間雙側頸總動脈夾閉即刻和再灌注即刻動物動脈血氣分析無統(tǒng)計學差異,排除低氧血癥影響

8、。2.Nissl染色結果:CI+vehicle組與 CI+rhTrx-1組健康神經元數(shù)目較 sham組相比均明顯降低(P<0.01);而CI+rhTrx-1健康神經元較 CI+vehicle組數(shù)量增加(P<0.01)。3.曠場實驗:結果顯示活動總路程及中央?yún)^(qū)活動時間兩檢測指標各組間均無統(tǒng)計學差異(P>0.05),說明腦缺血并沒有影響小鼠自主運動能力。4. Morris水迷宮:實驗結果表明,與CI+vehicle組相比,CI+rhTrx-

9、1組小鼠空間學習和記憶能力明顯提高,游泳總路程和游泳速度各組間沒有統(tǒng)計學差異說明小鼠認知能力的改善并不是因為肌力下降所引起的。
　　結論： rhTrx-1可以改善腦缺血后小鼠空間學習和記憶能力。
　　實驗二 rhTrx-1對腦缺血后海馬齒狀回神經再生的影響
　　目的：探討rhTrx-1對腦缺血后海馬齒狀回神經再生作用的影響,建立認知功能與神經再生之間的聯(lián)系。
　　方法：8-12周齡 SPF級雄性 C57BL/6J

10、小鼠(18-22g),隨機分為3組(n=12):sham, CI+vehicle組和 CI+rhTrx-1組,分別于BCCAO再灌注后14d進行 BrdU/Hoechst、Ki67/Hoechst和 DCX免疫熒光染色檢測 rhTrx-1對腦缺血后海馬神經干細胞增殖作用的影響;于 BCCAO再灌注后30d進行 BrdU/NeuN免疫熒光染色,檢測 rhTrx-1對腦缺血后海馬神經干細胞增殖作用的影響。
　　結果：海馬齒狀回神經干細

11、胞增殖情況:1. BrdU和 Ki67染色結果。CI+vehicle組 BrdU+細胞較 Sham組相比增加至約1.5倍(P<0.05);較 CI+vehicle組相比 CI+rhTrx-1組 BrdU+細胞數(shù)增加顯著(P<0.01)。同樣,較 Sham組相比CI+vehicle組 Ki67+細胞增加明顯(P<0.05),并且在 CI+rhTrx-1組 Ki67+細胞數(shù)增加至約2倍(P<0.01)。2. DCX染色結果。較 CI+veh

12、icle組相比海馬齒狀回中 CI+rhTrx-1組 DCX+細胞數(shù)明顯增加(P<0.01)。海馬齒狀回神經干細胞分化情況:BrdU+/NeuN+染色結果。CI+rhTrx-1組 BrdU+細胞較 CI+vehicle組明顯增加(P<0.01),表示 rhTrx-1可促進新生神經元數(shù)目的增加及存活;但是,免疫熒光雙標染色顯示,與 CI+vehicle組相比 BrdU+/NeuN+與 BrdU+的比例卻沒有變化(P>0.05),說明rhTr

13、x-1對缺血后海馬齒狀回神經干細胞分化沒有影響。
　　結論：rhTrx-1可以促進小鼠全腦缺血后海馬齒狀回神經干細胞增殖,但對其分化沒有影響。
　　實驗三 rhTrx-1對離體培養(yǎng)神經干細胞再生的影響及機制研究
　　目的：探討 rhTrx-1對離體培養(yǎng)神經干細胞再生的影響,明確其相關機制。
　　方法：清潔級孕14-16d的Sprague-Dawley(SD)大鼠,由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供,進行原代海馬神經干

14、細胞培養(yǎng)、鑒定和傳代。1.離體培養(yǎng)神經干細胞分為5組:Vehicle,1,10,50,100μg/ml rhTrx-1組,48h后觀察在不同濃度 rhTrx-1作用下神經干細胞的增殖情況。2.離體培養(yǎng)神經干細胞分為5組:Vehicle,1,10,50,100μg/ml rhTrx-1組,7d后觀察在不同濃度 rhTrx-1作用下神經干細胞的分化情況。3.離體培養(yǎng)神經干細胞分為4組:0h,2h,24h,48h組,48h后觀察在10μg/m

15、l rhTrx-1作用下不同時間點神經再生相關信號通路 MEK/ERK和 PI3K/Akt表達變化情況。4.離體培養(yǎng)神經干細胞共為4組:Vehicle, rhTrx-1, U0126, rhTrx-1+U0126組,觀察 MEK/ERK信號通路抑制劑---U0126對 rhTrx-1促神經干細胞增殖(培養(yǎng)48h)和分化(培養(yǎng)7d)作用的影響。
　　結果：1.離體培養(yǎng)神經干細胞鑒定:免疫熒光染色結果顯示無論是克隆球還是單個神經干細胞

16、均表達神經干細胞的標記物---巢蛋白。2.離體培養(yǎng)神經干細胞增殖情況:1).細胞活力檢測結果顯示:10,50,100μg/ml rhTrx-1組細胞活力較 Vehicle組相比明顯增加(P<0.01),三組濃度間相比無統(tǒng)計學差異。2). BrdU和 Ki67免疫熒光染色結果:10,50,100μg/ml rhTrx-1組 BrdU+細胞數(shù)目明顯增加(P<0.01);1,10,50μg/ml rhTrx-1組 Ki67+細胞數(shù)目明顯增加(

17、1μg/ml P<0.05;10,50μg/ml P<0.01)。3.離體培養(yǎng)神經干細胞分化情況:1). Tuj1和 GFAP免疫熒光染色結果:與 Vehicle組(7.21％)相比,1,10μg/ml rhTrx-1組 Tuj1+細胞數(shù)目明顯增加(1μg/ml P<0.05,13.51%;10μg/ml P<0.01,18.08%);同樣,1,10μg/ml rhTrx-1組GFAP+細胞數(shù)目明顯降低(P<0.05)。2). West

18、ern Blot分析結果同樣表明:10μg/ml rhTrx-1組 Tuj1表達量增加約1.5倍(P<0.05),GFAP的表達量在10μg/ml rhTrx-1組也明顯下降(P<0.05)。4. MEK/ERK而不是PI3K/Akt信號通路參與rhTrx-1的促神經再生作用: Western Blot結果顯示rhTrx-1加入2h后 pERK表達開始增加(P<0.05),直至48h仍能維持較高水平(P<0.01);而 pAkt表達無明

19、顯變化(P>0.05)。5. MEK/ERK信號通路抑制劑---U0126抑制了 rhTrx-1的促神經再生作用:1). Western Blot結果顯示U0126可以抑制rhTrx-1促進的pERK表達增加(P<0.05)。2).免疫熒光染色的結果顯示 U0126可以抑制rhTrx-1促進的BrdU+(P<0.05)和Tuj1+(P<0.01)細胞數(shù)目增加。
　　結論：rhTrx-1可以促進離體培養(yǎng)神經干細胞增殖和分化作用,并且

20、MEK/ERK而不是PI3K/Akt信號通路參與了 rhTrx-1的促神經再生作用。
　　總結
　　我們研究發(fā)現(xiàn),外源性給予 rhTrx-1可以促進小鼠全腦缺血后海馬齒狀回神經再生,改善腦缺血后小鼠空間學習和記憶能力,發(fā)揮神經保護作用。其機制可能與rhTrx-1可以促進神經干細胞增殖和分化作用有關,并且 MEK/ERK信號通路參與了 rhTrx-1的促神經再生作用,初步構建了 rhTrx-1促神經再生作用與 MEK/ERK信