NMDA受體激活在急性肺損傷CCTα表達下調中的作用及機制.pdf

1、第一章 MK801對小鼠油酸型肺損傷的保護作用研究背景急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是臨床常見危重疾病，發(fā)病機制尚未完全闡明。肺內(nèi)中性粒細胞、巨噬細胞的滯留和激活在ARDS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。中性粒細胞、巨噬細胞可釋放谷氨酸。Said等人發(fā)現(xiàn)谷氨酸離子型受體特異性激動劑N-甲基-D-門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)可引起離體灌流肺發(fā)

2、生高通透性肺水腫。近年來本室的研究還發(fā)現(xiàn)NMDA受體阻斷劑MK-801對脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)和高氧等引起的肺損傷具有明顯的保護作用，這些研究進一步提示內(nèi)源性谷氨酸(Glutamate，Glu)的大量釋放過度激活NMDA受體參與急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程。但為證明內(nèi)源性Glu的大量釋放過度激活NMDA受體在急性肺損傷的發(fā)生中具有普遍意義，尚有待在不同模型上進一步證實。 方法：(1)建立小鼠急性油酸肺

3、損傷模型；(2)測量肺濕重和干重的比值(W/D)并觀察肺組織病理變化，以反映腫組織的損傷程度；(3)測定支氣管肺泡灌洗液中蛋白和白細胞含量，以反映支氣管肺泡毛細血管通透性變化；(4)生化測定腫組織髓過氧化物酶(MPO)，反映氧化損傷時的肺炎性改變；(5)RT-PCR和免疫組化分別檢測CTP:磷酸膽堿二胞苷?；D移酶α(CTP：phosphocholine cytidylyltransferase alpha，CCTα)mRNA和蛋白水平

4、，反映CCTα轉錄合成的變化。 結果：油酸(0.1 ml/kg)尾靜脈注射4 h可引起腫組織肺指數(shù)、肺濕干重比W/D增加、肺組織MPO活性增加，支氣管肺泡灌洗液中蛋白和白細胞含量明顯增加，并引起肺組織CCTα mRNA和蛋白水平的明顯減低，病理切片示水腫、炎癥滲出明顯。NMDA受體的阻斷劑MK-801(0.1mg/kg，ip)預處理30 min可減輕油酸引起的上述變化。 結論：油酸引起明顯以炎性滲出為主的急性腫損傷，肺內(nèi)

5、NMDA受體的激活參與油酸急性腫損傷的發(fā)生，并引起CCTα表達的下調。 第二章 研究背景：CTP：磷酸膽堿二胞苷?；D移酶(CTP：phosphocholine cytidylyltransferase alpha，CCTα)是磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)合成中的關鍵調控酶。CCTα基因近端啟動子區(qū)包含多個與細胞生長、分化密切相關的轉錄因子Sp1(specificity protein 1)

6、結合位點。探討Sp1在CCTα啟動轉錄中的作用具有一定的意義。在急性肺損傷(acute lung injury，ALI)及ARDS等腫部損傷疾病中，肺表面活性物質(pulmonary surfactant，PS)系統(tǒng)功能的異常并參與肺損傷的發(fā)生過程。本室前期研究證明一定劑量NMDA作用后，肺Ⅱ型上皮細胞合成CCT mRNA水平、CCTα蛋白表達水平均下降。本研究旨在觀察NMDA受體激活后Sp1的改變，探討NMDA抑制CCTα表達的分子機

7、制。 方法： (1)螢光素酶報告基因活性檢測CCTα啟動子活性；(2)熒光定量PCR定量檢測Sp1表達質粒后CCTα mRNA；(3)Westem blot檢測A549細胞轉染Sp1表達質粒后CCTα蛋白含量表達水平；(4)Westem blot檢測A549細胞經(jīng)NMDA處理后Sp1蛋白含量表達水平；(5)熒光定量PCR定量檢測A549細胞經(jīng)NMDA處理后Sp1mRNA水平；(6)EMSA檢測CCTα啟動子上Sp1的DNA結合活

8、性及NMDA處理對其影響。 結果 轉染Sp1真核表達質粒30 h后，A549細胞CCTα核心啟動子報告基因相對螢光素酶活性增加，A549細胞CCTα m RNA表達水平表達水平增高。轉染Sp1真核表達質粒36 h后，CCTα蛋白表達水平表達水平增高。A549細胞經(jīng)NMDA處理8 h后，Sp1蛋白表達明顯下降，并呈時間、劑量依賴。Sp1 mRNA水平?jīng)]有明顯的改變。EMSA檢測顯示，NMDA處理后A549細胞的核蛋白中轉錄因子