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1、華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與CERKL相互作用的蛋白姓名:王磊申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別:碩士專(zhuān)業(yè):無(wú)機(jī)化學(xué)指導(dǎo)教師:楊祥良劉木根20080605華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文IIABSTRACTRetinitispigmentosa(RP)isageicallyheterogeneousdisderacterizedbyprogressivelossofphoteceptsbyapoptosis.In1998a
2、SpanishgroupperfmedlinkageanalysisinalargenuclearSpanishfamilywithautosomalrecessiveretinitispigmentosafinemappedtheRP26locusinthisfamilytoa2.5Mbregiononchromosome2q31.2q32.3.TheyidentifiedanovelgeneCERKLintheRP26critica
3、llinkageregionfoundahomozygousmutationinexon5ofthegeneintwoSpanishfamilies.HoweverthephysiologicalfunctionsofCERKLinretinamolecularmechanismbywhichCERKLmutationcausingRPremainsunclear.Therehavebeenonly5publicationsonCERK
4、Lrepteduntilnow.IndertostudybiologyfunctionofCERKLrevealitspathwayintheretinaweclonedthefulllengthCERKLgenescreenedtheproteinsinteractedwithCERKLbyusingYeastTwoHybridSystem.WefirstlyclonedthefulllengthCERKLgeneusingneste
5、dPCRfromHeLacellcDNAlibrary.SecondlytheYeastTwoHybridSystem(Clontech)wasusedtoscreenahumanpancreasGAL4ADcDNAlibrarywithhumanCERKLcDNAfusedtoGAL4BDinplaspGBKT7asbait.ThenwetransfmedthepGBKT7CERKLintoyeastAH109toexaminethe
6、toxicityselfactivationofpGBKT7CERKLplas.AfterthatpGBKT7CERKLthelibraryplassweretransfmedsequentiallyintoyeaststrainAH109.ThetransfmantswereplatedonSDagartoscreenfinteractingpartnersaccdingtothemanufacturer’sinstructions.
7、560preliminarypositivecloneswerefurthercheckedbyphenotypesretestingclonesstingαgalactosidaseactivitydetectingtoexcludethefalsepositiveclones.PlassrecoveredfrompositivecloneswereamplifiedbyPCRfthessequenced.Thesequencingr
8、esultsofthecidatecloneswereanalyzedusingtheBLASTdatabasetofindthepotentialinteractionofproteins.TwoproteinsCTRC(HomosapienschymotrypsinCpreproprotein)EIF3S9(Homosapienseukaryotictranslationinitiationfact3subunit9)wereide
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