初免加強(qiáng)免疫增強(qiáng)肺炎鏈球菌表面黏附素(psaA)核酸疫苗免疫原性研究.pdf

1、肺炎鏈球菌是導(dǎo)致細(xì)菌性肺炎、菌血癥、腦膜炎等侵襲性疾病的重要原因,同時(shí)也是導(dǎo)致急性中耳炎和鼻竇炎的主要病原菌。由于抗生素的廣泛運(yùn)用,已導(dǎo)致多種耐藥菌的產(chǎn)生。已經(jīng)用于臨床的預(yù)防疫苗主要為23價(jià)多糖疫苗和7價(jià)多糖蛋白結(jié)合疫苗,但前者是T細(xì)胞非依賴性抗原,對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善的2歲以下嬰幼兒以及老年人的保護(hù)性有限;后者包含的血清型有限,而且生產(chǎn)成本高,不適合在我國(guó)大范圍應(yīng)用。
　　 PsaA是肺炎鏈球菌毒力因子之一,屬于金屬結(jié)合脂蛋白

2、家族成員,分子量為37-kDa,有309個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成,其氨基酸序列和免疫原性高度保守,屬于ABC-型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,PsaA在ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)體系中屬于細(xì)胞膜外蛋白質(zhì),一項(xiàng)功能是負(fù)責(zé)結(jié)合金屬錳離子和鋅離子;另一項(xiàng)功能是肺炎鏈球菌的一種黏附素。
　　 本研究根據(jù)基因庫(kù)中肺炎鏈球菌表面黏附素的基因序列(序列號(hào)U53509),設(shè)計(jì)引物,運(yùn)用PCR法從肺炎鏈球菌基因組中克隆出psad基因,回收PCR產(chǎn)物并對(duì)其進(jìn)行酶切,將其分別插入到pVAX1

3、真核表達(dá)載體和pET28a原核表達(dá)載體,分別構(gòu)建出表達(dá)PsaA的核酸疫苗pVAX1-psaA及其重組原核表達(dá)載體pET28a-psaA,并對(duì)它們進(jìn)行鑒定。將pET28a-psaA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)ITPG誘導(dǎo),采用鎳柱親和層析法純化PsaA蛋白,Western-blot分析其抗原性。
　　 10只BALB/c小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,將構(gòu)建正確的核酸疫苗pVAX1-psaA對(duì)BALB/c小鼠(n=5)進(jìn)行3次核

4、酸疫苗免疫,隔周免疫一次,共3次,為初免,第三次免疫2周后,腹腔免疫50μg組PsaA純化蛋白。對(duì)照組僅隔周免疫3針100μgpVAX1空載體,加強(qiáng)免疫50μl生理鹽水。所有動(dòng)物分別于0、2、4、6、7周尾靜脈取血,間接ELISA法測(cè)定其抗PsaA抗體水平。
　　 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明我們成功克隆出psaA基因并實(shí)現(xiàn)其亞克隆;所構(gòu)建的psaA核酸疫苗序列正確,同時(shí)成功實(shí)現(xiàn)了PsaA蛋白純化;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明核酸疫苗初免后蛋白加強(qiáng)組的抗