羅非魚無乳鏈球菌C5a肽酶的原核表達及其免疫原性研究.pdf

1、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)是一種廣泛分布于自然界的革蘭氏陽性菌,可導(dǎo)致水生動物、哺乳動物及人類等患敗血癥、肺炎及腦膜炎等疾病。無乳鏈球菌已經(jīng)成為多種魚類的主要致病菌,尤其是暖水性魚類,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè),特別是集約化魚類養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟損失,也是危害我國養(yǎng)殖羅非魚的主要病害,已經(jīng)嚴重阻礙了我國羅非魚產(chǎn)業(yè)鏈的健康發(fā)展。本研究以羅非魚無乳鏈球菌為對象,通過生物信息學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù),克隆了無乳鏈球菌ZP-N

2、菌株C5a肽酶scpB基因,分析了ScpB蛋白抗原表位的分布,并利用原核表達獲得了有活性的重組蛋白,同時對該蛋白的免疫原性進行了研究。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1無乳鏈球菌scpB基因的克隆及原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建
　　為了解無乳鏈球菌表面蛋白C5a肽酶scpB基因免疫表位及毒力作用基團的相關(guān)信息,本文通過提取羅非魚無乳鏈球菌基因組DNA,利用特異性引物PCR擴增出scpB基因的全長開放閱讀框(ORF)。結(jié)果表明,該基因包括

3、3405bp的ORF,可編碼1134個氨基酸,與已報道的人源無乳鏈球菌ScpB的氨基酸同源性達99.74％。利用生物信息學(xué)軟件DNAstar、Clustal X2.0和MEGA5.05及在線分析工具ExPASy ProtParam、NCBI Proten blast及Conserved Domain等對推導(dǎo)的氨基酸序列進行分析,結(jié)果顯示羅非魚無乳鏈球菌scpB基因編碼的氨基酸序列含有3個催化三聯(lián)體(Catalytic triad)位點,

4、7個假定活性位點(Putative active site),2個特異位點(Specific hits),以及4個超家族結(jié)構(gòu)(2個肽酶超家族結(jié)構(gòu)Peptidases-S8-S53 superfamily,1個類纖連蛋白超家族結(jié)構(gòu) DUF1034 superfamily和1個鞭毛鉤蛋白超家族結(jié)構(gòu)FlgD-lg superfamily)。ScpB氨基酸序列有多個抗原表位,推測ScpB蛋白應(yīng)具有較強的免疫原性,可作為候選的蛋白疫苗成分。將該基

5、因片段插入原核表達載體pET32a(+),轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)。挑取陽性克隆,經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定表明成功構(gòu)建原核表達載體pET32a+/scpB,為獲得大量ScpB蛋白開展其免疫防治提供了條件。
　　2無乳鏈球菌C5a肽酶的原核表達及其免疫原性研究
　　本研究從本實驗室分離到的羅非魚無乳鏈球菌基因組DNA中擴增出scpB基因高保守片段,構(gòu)建原核表達質(zhì)粒 pET32a(+)-scpB,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21(

6、DE3)中,IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達,表達的重組蛋白用鎳離子金屬螯合柱純化及超濾管濃縮除鹽,采用SDS-PAGE和Western blot進行鑒定。純化的融合蛋白與弗氏佐劑按一定比例混合制成疫苗后免疫羅非魚以分析其免疫原性。免疫羅非魚后,每周采血測各組血清中溶菌酶活性、超氧化物歧化酶(SOD)活力及抗體水平變化情況,直至實驗結(jié)束。免疫羅非魚4周后對其進行人工攻毒試驗,結(jié)果顯示:免疫組的相對免疫保護率達69.66%-89.0%,其中5μg

7、/g劑量組的保護率最高;免疫后血清中溶菌酶活性、SOD活力和抗體水平得到極顯著的提高(P<0.01)。本研究表明重組蛋白ScpB具有較強的免疫原性和保護作用,為無乳鏈球菌多肽疫苗的研制和該蛋白的結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析奠定了基礎(chǔ)。
　　3 PLGA為佐劑的C5a肽酶納米疫苗對羅非魚無乳鏈球菌病的免疫效果研究
　　利用超聲乳化法技術(shù),采用生物可降解材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)包裹無乳鏈球菌表面蛋白ScpB制成緩釋微球疫苗,不同

8、濃度注射免疫羅非魚。監(jiān)測受免魚體血清中溶菌酶活性、SOD活力及抗體(IgM)水平變化情況,并計算其人工攻毒后相對免疫保護率。結(jié)果表明,制備的微球疫苗中蛋白的載藥率達2.55%,包封率為48.76%。免疫組血清中溶菌酶活性、SOD活力和抗體水平極顯著提高(P<0.01);免疫組的相對免疫保護率達66.80%-87.66%,其中1μg/g劑量組(P1)的保護率最高。該結(jié)果表明采用PLGA作為無乳鏈球菌ScpB蛋白疫苗的載體和佐劑具有較好的免