羅非魚無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)LrrG蛋白的原核表達(dá)及其免疫原性研究.pdf

1、近年來，羅非魚養(yǎng)殖過程中鏈球菌病頻繁爆發(fā)，嚴(yán)重影響了我國羅非魚產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，目前鏈球菌病防控已成為羅非魚養(yǎng)殖中的重點(diǎn)及難點(diǎn)。無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）是羅非魚鏈球菌病的主要病原之一。LrrG蛋白是無乳鏈球菌表面較保守的蛋白之一，具有非血清型依耐性，是理想的候選疫苗抗原和免疫檢測靶標(biāo)。為獲得羅非魚源無乳鏈球菌LrrG蛋白并探討其在羅非魚體內(nèi)的免疫原性，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)GenBank中已報(bào)道的人源無乳鏈球菌

2、LrrG基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增獲得羅非魚源無乳鏈球菌的LrrG基因；利用 NCBI的Conserved domain和PSIPRED分析LrrG蛋白的結(jié)構(gòu)域和二級(jí)結(jié)構(gòu)，DNAStar軟件預(yù)測 LrrG蛋白能否形成抗原表位；將 LrrG基因片段克隆轉(zhuǎn)入原核表達(dá)載體pET-32a(+)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)/LrrG，再導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，低溫誘導(dǎo)表達(dá)LrrG蛋白；并以LrrG蛋白對(duì)羅非魚分別進(jìn)

3、行注射和口服免疫實(shí)驗(yàn)，探究其免疫原性及最佳免疫方式。主要研究結(jié)果與結(jié)論如下：
　　1、羅非魚無乳鏈球菌LrrG基因與氨基酸序列分析
　　本實(shí)驗(yàn)根據(jù)GenBank中已報(bào)道的人源無乳鏈球菌LrrG基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增獲得羅非魚源無乳鏈球菌的LrrG基因。分析表明，其ORF為2361 bp，編碼786個(gè)氨基酸，與人源無乳鏈球菌 LrrG基因（GenBank登錄號(hào)：AY909605.1）核苷酸序列的相似性高達(dá)98.48％。

4、DNAstar-EditSeq預(yù)測表明，羅非魚無乳鏈球菌LrrG基因的ORF編碼1條由786個(gè)氨基酸殘基組成的肽鏈，相對(duì)分子量為88.5141 kDa，理論等電點(diǎn)為9.26，分子式為C3951H6343N1095O1184S12，含有3個(gè)保守的LRR結(jié)構(gòu)域。親/疏水性分析表明，LrrG多肽鏈有3個(gè)主要的疏水區(qū)，親水區(qū)域遠(yuǎn)大于疏水區(qū)域。DNAStar-Protean推測LrrG蛋白可以形成多個(gè)抗原表位。
　　2、羅非魚無乳鏈球菌Lr

5、rG重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與原核表達(dá)
　　將 LrrG基因片段克隆轉(zhuǎn)入原核表達(dá)載體 pET-32a(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a(+)/LrrG，轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)中，IPTG22℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。SDS-PAGE顯示，誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的分子量為108.9 kDa，并且該重組蛋白以可溶和包涵體2種形式存在。經(jīng)His Bind親和柱純化獲得LrrG純蛋白，超濾管濃縮后LrrG可溶蛋白和包涵體蛋白濃度分別達(dá)3.40和3.

6、19 mg/mL。經(jīng)Western blot檢測，純化后的LrrG可溶蛋白和包涵體條帶單一、清晰。
　　3、羅非魚無乳鏈球菌LrrG蛋白的免疫原性分析
　　初步魚體注射免疫實(shí)驗(yàn)表明，LrrG蛋白對(duì)羅非魚的相對(duì)免疫保護(hù)率達(dá)69.28%，且免疫后4周的血清抗體滴度為1:800，免疫后2周血清抗體最大OD值為0.3515，免疫后4周為0.4635。
　　采用PLGA作為佐劑，復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備PLGA-LrrG蛋白微球，微球

7、平均粒徑為4.5μm，包封率為38.54%，載藥量為1.98%。體外釋放曲線顯示，該微球突釋時(shí)間為前8 h，突釋量占27.74%，之后進(jìn)入緩釋階段，28 d的累積釋放量達(dá)78.97%。PLGA-LrrG蛋白微球分別以注射和口服的方式免疫健康羅非魚。各實(shí)驗(yàn)組均顯示具有免疫保護(hù)力。注射0.5μg/g(蛋白量/魚的體重)、1μg/g PLGA-LrrG蛋白微球，免疫保護(hù)率較高，分別達(dá)77.89%和77.81%；而注射2μg/g PLGA-Lr

8、rG蛋白微球免疫保護(hù)率略低?？诜?μg/g PLGA-LrrG蛋白微球較口服0.5μg/g、2μg/g蛋白微球免疫保護(hù)率高，達(dá)77.54%。此外，注射組免疫保護(hù)率普遍高于口服組。
　　羅非魚經(jīng)注射和口服方式免疫PLGA-LrrG蛋白微球后，其血清抗體水平和溶菌酶活性均顯著高于對(duì)照組，注射組比口服組略高。空載 PLGA微球與 PBS組的血清抗體水平和溶菌酶活性均無顯著差異，表明LrrG蛋白能夠引起羅非魚特異性和非特異性免疫反應(yīng)。本研