基于核酸適配體的細(xì)菌內(nèi)毒素液相和固-液相檢測方法研究.pdf

1、感染性疾病是世界十大致命性疾病之一,尤其是在發(fā)展中國家,兒童和外傷患者因感染性疾病導(dǎo)致的死亡率較高。在感染性疾病中,以革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria,GNB)感染敗血癥、內(nèi)毒素血癥及其休克的臨床死亡率最高。GNB感染時(shí),細(xì)菌和/或脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)即內(nèi)毒素(Endotoxin)進(jìn)入血循環(huán),激活多種炎癥細(xì)胞釋放炎性介質(zhì),引起炎癥反應(yīng),嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致多器官功能衰竭。
　　

2、 LPS是GNB外膜的主要成分,由類脂A、核心寡聚糖和O-特異性多糖側(cè)鏈三部分組成。LPS對(duì)于維持GNB的外膜滲透性和流動(dòng)性及其致病過程起主要作用。LPS還可直接或間接誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡,抑制機(jī)體免疫功能,從而加重?cái)⊙Y的發(fā)生,因此LPS的檢測具有重要的醫(yī)學(xué)意義。目前臨床上內(nèi)毒素的檢測方法,主要有鱟變形細(xì)胞溶解物(LAL)試驗(yàn)、動(dòng)態(tài)濁度法、與重組因子C相關(guān)的檢測方法等,但主要還是以鱟變形細(xì)胞溶解物試驗(yàn)最為常用,該方法靈敏度和特異性較高,但

3、對(duì)LPS的污染極為敏感,對(duì)所用器皿的消毒要求高,且活性易受某些金屬離子、抗生素、氨基酸、糖類、血漿蛋白等影響,檢測品種有限。
　　 近年的研究表明,DNA和RNA不僅僅起遺傳信息儲(chǔ)存和傳遞的作用,而且可以通過自身特有的結(jié)構(gòu)與其它類型分子相互作用,以此為基礎(chǔ)可以建立人工設(shè)計(jì)的隨機(jī)寡核苷酸庫,從這類隨機(jī)序列庫中篩選出與靶分子高度特異結(jié)合片段的過程,稱為指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化配體(systematic evolution of ligand

4、s byexponential enrichment,SELEX),篩選出的分子被稱為“核酸適配體”(適體,aptamer),其作用形式與抗體相似,可與靶分子高親和力、特異性的結(jié)合,其解離常數(shù)可達(dá)到pg級(jí)。
　　 本課題擬采用核酸適配體技術(shù)研究出一種靈敏度高、特異性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、且不易受外界因素影響的新型細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法,同時(shí)也可為相關(guān)的內(nèi)毒素檢測試劑盒或生物傳感器的研發(fā)提供基礎(chǔ),既能滿足對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢測快速準(zhǔn)確的要求,又能降

5、低檢測成本,擴(kuò)大應(yīng)用范圍,為臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等與人們?nèi)粘Ｉ钕⑾⑾嚓P(guān)的領(lǐng)域中的內(nèi)毒素檢測開創(chuàng)新的途徑。
　　 方法:1緩沖溶液的選擇。選取新鮮滅菌注射用水(WFI,pH=5.61,內(nèi)毒素含量<0.03 EU/ml)、磷酸鹽緩沖液(PBS,0.1mol/L,pH=7.3,用滅菌純凈水配制)和三羥甲基氨基甲烷(Tris,0.02mol/L,pH=7.4)參與培育內(nèi)毒素與核酸適配體的介質(zhì)環(huán)境選擇性實(shí)驗(yàn)。2 培育時(shí)間的優(yōu)化。

6、選擇PBS作為培育介質(zhì)進(jìn)行最佳培育時(shí)間的選擇試驗(yàn),根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)和多次的預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,具體的時(shí)間分組為30 min、1 h、2 h、2 h、4 h。3 核酸適配體最佳摩爾量的優(yōu)化。分別選取5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L 劑量組的核酸適配體進(jìn)行最佳摩爾量的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。4 內(nèi)毒素核酸適配體檢測的選擇性比較。核酸適配體的選擇性是衡量該方法優(yōu)劣的重要因素之一。隨機(jī)選取一段核酸適配體,即Aptamer

7、Ⅲ分別取代Aptamer Ⅰ和Aptamer Ⅱ與LPS反應(yīng),以確定LPS與其他Aptamer是否有非特異性結(jié)合。5 基于核酸適配體用于內(nèi)毒素的固-液相檢測。綜合以上各種檢測條件的優(yōu)化結(jié)果,并將內(nèi)毒素分為0.0312 EU/ml、0.0625 EU/ml組、0.125 EU/ml組、0.25 EU/ml組、0.5 EU/ml組、1 EU/ml組、2 EU/ml組、4 EU/ml組,進(jìn)行內(nèi)毒素核酸適配體的固-液相檢測。6 基于核酸適配體用

8、于內(nèi)毒素的檢測(液相檢測)。將羥基活化的磁性納米顆粒與一條5ˊ端帶氨基修飾的適體(Aptamer,核酸適配體)反應(yīng)結(jié)合,利用適體與LPS的強(qiáng)結(jié)合作用捕獲LPS分子,并通過磁性分離技術(shù)去除雜質(zhì)蛋白干擾。另一條帶熒光標(biāo)記的適體結(jié)合LPS的另一位點(diǎn),用以測定LPS的量。7 凝膠法檢測磁珠分離液。將吸附在磁珠上的細(xì)菌內(nèi)毒素和核酸適配體結(jié)合物用特定的方法洗脫下來,并用鱟試劑對(duì)洗脫液進(jìn)行檢測,以證實(shí)內(nèi)毒素液相檢測的有效性。8 固-液相和液相檢測反應(yīng)

9、液穩(wěn)定性檢測。將固-液相和液相檢測反應(yīng)液分別置于37℃恒溫箱內(nèi)放置6 h、12 h、24 h,再用熒光分光光度計(jì)測其熒光值。9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。均采用SPSS13.0版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,基于核酸適配體的內(nèi)毒素液相和固相-液相檢測用雙變量相關(guān)分析(Pearson's)進(jìn)行分析；單變量方差分析和析因設(shè)計(jì)的方差分析用于緩沖溶液的選擇、培育時(shí)間的優(yōu)化、核酸適配體劑量的優(yōu)化、內(nèi)毒素核酸適配體檢測的選擇性比較實(shí)驗(yàn),所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示

10、,另外,用兩兩比較LSD分析方法進(jìn)行各實(shí)驗(yàn)組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)驗(yàn)證。
　　 結(jié)果:1 緩沖溶液的選擇。內(nèi)毒素在新鮮滅菌注射用水(WFI)、磷酸鹽緩沖液(PBS)和Tris緩沖液與核酸適配體共同孵育,都可產(chǎn)生相互的親和作用(F=2227.874,P=0.000)。內(nèi)毒素在三種緩沖液中的熒光信號(hào)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.119,P=0.889)。磷酸鹽緩沖液和三羥甲基氨基甲烷緩沖液中所含的Mg2+、ca2+、Na+和K+等離子的濃度對(duì)內(nèi)毒

11、素與其核酸適配體的結(jié)合沒有影響。選擇這三種緩沖液中的其中一種作為內(nèi)毒素與核酸適配體孵育的介質(zhì)環(huán)境均可行。2培育時(shí)間的優(yōu)化。在孵育初期,隨著時(shí)間的逐漸增加,熒光強(qiáng)度慢慢增強(qiáng),內(nèi)毒素結(jié)合核酸適配體的量逐漸增加,孵育2 h后熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定,在該濃度下,熒光強(qiáng)度基本達(dá)到飽和狀態(tài),此時(shí)內(nèi)毒素與核酸適配的結(jié)合作用基本完成,在各時(shí)間段里內(nèi)毒素均可與核酸適配體產(chǎn)生結(jié)合作用(F=922.448,P=0.000)。另外,對(duì)于2 h和4 h所測得的結(jié)果,兩

12、者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.850),在此選擇2 h作為核酸適配體與內(nèi)毒素的培育時(shí)間。3 核酸適配體最佳摩爾量的的優(yōu)化。內(nèi)毒素與不同濃度的核酸適配體Ⅰ結(jié)合后再與固定濃度的核酸適配體Ⅱ反應(yīng),各個(gè)濃度劑量組均與內(nèi)毒素產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)(F=17323.631,P=0.000)。從最小濃度的5μmol/L,開始熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),尤其是5μmol/L到10 μmol/L之間的坡度最明顯,析因設(shè)計(jì)資料的兩兩比較統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,兩劑量組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)

13、學(xué)意義(P<0.001),10 μmol/L到80μmol/L的熒光數(shù)值漸趨穩(wěn)定,
　　 經(jīng)多重比較統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,不同濃度之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.5),在此選擇10 μmol/L的核酸適配體Ⅰ作為孵育濃度。內(nèi)毒素和固定濃度的核酸適配體Ⅰ結(jié)合后與不同濃度的核酸適配體Ⅱ孵育過程中,各個(gè)劑量組均與內(nèi)毒素產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)(F=22658.582,P=0.000)。從最小濃度的5 μmol/L開始熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),尤其是5 μmol/

14、L到10μmol/L之間的坡度最明顯,析因設(shè)計(jì)資料的兩兩比較統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,兩劑量組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),10μmol/L到80μmol/L的熒光數(shù)值漸趨穩(wěn)定,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,它們之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.5),因此,選擇10μmol/L的核酸適配體Ⅱ作為孵育濃度。4 內(nèi)毒素核酸適配體檢測的選擇性比較。當(dāng)以任意DNA系列代替檢測中的一條核酸適配體時(shí),都不能形成三明治結(jié)構(gòu),在溶液中檢測不到明顯的熒光,經(jīng)過各序列

15、組間析因設(shè)計(jì)資料的方差分析兩兩比較統(tǒng)計(jì)學(xué)比較驗(yàn)證,B和C曲線之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.909)。僅當(dāng)溶液中存在與內(nèi)毒素兩個(gè)作用位點(diǎn)特異性結(jié)合的兩條核酸適配體時(shí)才能形成三明治結(jié)構(gòu),A和B、c曲線之間差異有顯著性意義(P=0.000)。5 基于核酸適配體用于內(nèi)毒素的固-液相檢測。熒光強(qiáng)度隨內(nèi)毒素劑量升高而升高,兩者呈線性關(guān)系,經(jīng)雙變量相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素和熒光強(qiáng)度兩者呈顯著相關(guān)關(guān)系(Pearson's:r=0.897,P=0.003)。經(jīng)

16、過檢測條件的優(yōu)化后,可以看到溶液中的熒光強(qiáng)度隨著內(nèi)毒素的劑量升高而升高,提示著運(yùn)用核酸適配體與靶標(biāo)內(nèi)毒素的強(qiáng)親和力來檢測內(nèi)毒素取得了較好的效果。6基于核酸適配體用于內(nèi)毒素的檢測(液相檢測)。熒光強(qiáng)度隨著內(nèi)毒素劑量的升高而升高,兩者呈線性關(guān)系,熒光強(qiáng)度呈明顯的LPS濃度依賴性增高,經(jīng)雙變量相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素和熒光強(qiáng)度兩者呈顯著相關(guān)關(guān)系(Pearson’s:r=0.867,P=0.005)。7 凝膠法檢測磁珠分離液。除了0.0312 EU/

17、ml組因劑量較小的緣故未見明顯陽性反應(yīng)之外,其余各組均出現(xiàn)不同程度的凝膠現(xiàn)象。由此判斷,把結(jié)合到磁珠上的物質(zhì)用特定的方法洗脫下來,并通過凝膠法證實(shí)磁珠分離液中含有內(nèi)毒素成份,也可間接反證上述的磁珠/核酸適配體/內(nèi)毒素結(jié)合實(shí)驗(yàn)是有效的。8 固-液相和液相檢測反應(yīng)液穩(wěn)定性檢測。在各時(shí)間段,即6 h組、12h組、24 h組熒光信號(hào)均未見明顯衰減,固-液相和液相兩種檢測方法檢測細(xì)菌內(nèi)毒素具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性,檢測結(jié)果不隨時(shí)間的增長而產(chǎn)生明顯變化。<

18、br>　　 結(jié)論:
　　 1 采用2個(gè)不同適體與內(nèi)毒素形成高親和力的三明治結(jié)構(gòu)用于檢測內(nèi)毒素方法可行,其檢測線性范圍寬,特異性強(qiáng),靈敏度高,檢測信號(hào)穩(wěn)定,重現(xiàn)性好,且不以內(nèi)毒素為靶標(biāo)的無關(guān)適體對(duì)其沒有干擾。
　　 2 液相檢測法中采用磁珠分離技術(shù)可大大消除非特異性吸附,進(jìn)一步提高檢測效率,敏感度比固-液相檢測法要高。
　　 3 基于核酸適配體用于內(nèi)毒素的固-液相檢測和液相檢測的檢測結(jié)果具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性,在24h