人4-1BBL-抗CD20融合蛋白增強(qiáng)抗CD3-抗CD20雙功能抗體的細(xì)胞毒作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目前，①常規(guī)的放、化療方案選擇性較差；②腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性；⑨腫瘤發(fā)生微小轉(zhuǎn)移是困擾腫瘤的臨床治療三大難題，雙功能抗體或融合蛋白因其具有同時(shí)與腫瘤相關(guān)抗原和免疫效應(yīng)細(xì)胞表面分子標(biāo)記結(jié)合，并能有效地使效應(yīng)細(xì)胞靶向殺滅腫瘤細(xì)胞的作用而倍受關(guān)注，最有希望成為解決這些問題的一條新途徑。
　　 在抗腫瘤免疫反應(yīng)中，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)起著重要作用。腫瘤免疫治療的目標(biāo)就是產(chǎn)生腫瘤特異性的具有長(zhǎng)期持續(xù)性殺傷活性的激活的CD8+T細(xì)胞。初始T細(xì)胞

2、的完全激活需要雙重信號(hào)刺激，即T細(xì)胞受體與抗原肽-MHC分子復(fù)合物結(jié)合的第一信號(hào)，又必須有T細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞表面多種共刺激分子相互作用提供的共刺激信號(hào)即第二信號(hào)。T細(xì)胞激活誘導(dǎo)階段若缺乏共刺激信號(hào)，會(huì)引起T細(xì)胞通過活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡途徑凋亡和克隆特異性無反應(yīng)性，進(jìn)而導(dǎo)致抗腫瘤免疫功能低下，而通過低表達(dá)共刺激分子降低免疫原性，使得識(shí)別它的抗原提呈細(xì)胞或淋巴細(xì)胞得不到充分的活化信號(hào)，是腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的重要機(jī)制之一，臨床實(shí)踐中，這類腫瘤的

3、治療效果和預(yù)后不佳。共刺激信號(hào)途徑在T細(xì)胞的活化和增殖過程中起著重要作用。CD28/B7分子是研究最多的協(xié)同刺激分子，認(rèn)為是初始T細(xì)胞激活發(fā)生最主要的機(jī)制，然而，近來研究的4-1BB/4-1BBL是TNFR/TNF配體家族的成員，它們分別表達(dá)在T細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞上，被確定有助于擴(kuò)增和多元化T細(xì)胞反應(yīng)，深入增強(qiáng)和延伸T細(xì)胞激活的功能，許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明干預(yù)4-1BB/4-1BBL共刺激途徑可調(diào)節(jié)T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞的功能產(chǎn)生抗腫瘤免疫作用

4、，為腫瘤的免疫治療提供了新的靶點(diǎn)。
　　 CD20主要表達(dá)在前B細(xì)胞和成熟B細(xì)胞及95％以上的NHL淋巴瘤細(xì)胞，是可以用來作為腫瘤定向免疫治療的抗原。為了特異性定向腫瘤細(xì)胞和激活腫瘤特異性T細(xì)胞，抗腫瘤免疫性能夠被誘導(dǎo)和恢復(fù)，利用雙特異抗體針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原與效應(yīng)細(xì)胞相連，共同作用于腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向治療，我們已成功構(gòu)建了抗CD3/抗CD20的diabody表達(dá)載體和人4-1BBL胞外區(qū)基因表達(dá)載體pAYZ4-1BBL并進(jìn)行

5、了體內(nèi)外生物活性測(cè)定，前者有的抑制腫瘤生長(zhǎng)的活性而后者則能抑制激活的T細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)基于PBL的抗腫瘤效應(yīng)。然而全身性的T細(xì)胞激活將導(dǎo)致不需要的臨床副作用，應(yīng)用4-1BBL和CD3單克隆抗體可代替專職抗原提呈細(xì)胞的刺激能力，因此基于4-1BBL和CD3雙信號(hào)所必須嚴(yán)格定位在腫瘤位點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了人4-1BBL胞外區(qū)/抗CD20融合蛋白，獲得可溶性表達(dá)在2-3mg/l，流式間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)及玫瑰花環(huán)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了人4-1BBL胞外

6、區(qū)/抗CD20融合蛋白具有與CD20+的Raji細(xì)胞和4-1BB+的Jurkat細(xì)胞結(jié)合活性。研究結(jié)果表明人4-1BBL胞外區(qū)/抗CD20融合蛋白能增強(qiáng)抗CD3/抗CD20 diabody介導(dǎo)PBLs對(duì)靶細(xì)胞Ra ji細(xì)胞的殺傷作用，其機(jī)制是上調(diào)抗凋亡相關(guān)基因bcl-xL和bfl-1mRNA的表達(dá)，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞死亡，促進(jìn)IL-2分泌及上調(diào)穿孔素和顆粒酶mRNA表達(dá)，更有效導(dǎo)致PBLs殺傷腫瘤細(xì)胞。應(yīng)用裸鼠移植瘤模型也表明聯(lián)