牛源犬新孢子蟲對(duì)孕鼠胎盤的損傷作用研究.pdf

1、犬新孢子蟲（Neospora caninum）是寄生于牛、羊、犬等多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的一種原蟲。犬新孢子蟲主要引起母畜流產(chǎn)、死胎或新生兒運(yùn)動(dòng)障礙和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。新孢子蟲病可垂直傳播，對(duì)牛的危害極為嚴(yán)重，已成為危害養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的主要因素之一。但犬新孢子蟲對(duì)胎盤的損傷及其機(jī)制目前尚不清楚。為確定牛源犬新孢子蟲對(duì)胎盤的損傷作用，本研究以BALB/c小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在建立牛源犬新孢子蟲孕鼠感染模型的基礎(chǔ)上，對(duì)孕鼠胎盤組織細(xì)胞進(jìn)行病理學(xué)損傷觀察

2、，孕鼠胎盤相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè)，孕鼠胎盤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)，以及影響孕鼠胎盤物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、胎盤血流和胎兒生長(zhǎng)發(fā)育等各項(xiàng)胎盤激素指標(biāo)檢測(cè)，以此闡明牛源犬新孢子蟲感染對(duì)胎盤組織細(xì)胞的損傷作用，以期為犬新孢子蟲致病作用的研究奠定基礎(chǔ)。
　　1、牛源犬新孢子蟲孕鼠感染模型的建立
　　本試驗(yàn)以雌性BALB/c小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分離Vero細(xì)胞中犬新孢子蟲速殖子，分不同劑量組腹腔接種雌性BALB/c小鼠，第二天與雄性BALB/c小鼠合籠，每天觀

3、察小鼠臨床癥狀和發(fā)病情況。應(yīng)用檢測(cè)犬新孢子蟲Nc5基因的PCR方法在攻蟲后第12 d即可以在胎盤中檢測(cè)到蟲體DNA，成功建立了牛源犬新孢子蟲孕鼠感染模型，確定了每個(gè)模型小鼠的攻蟲劑量為105個(gè)蟲體。
　　2、牛源犬新孢子蟲對(duì)孕鼠胎盤組織細(xì)胞的損傷觀察
　　本試驗(yàn)以牛源犬新孢子蟲孕鼠感染模型為研究對(duì)象，測(cè)定了胎盤重量和胎盤系數(shù)，病理學(xué)觀察孕鼠胎盤組織細(xì)胞損傷變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明，模型組孕鼠隨攻蟲

4、天數(shù)的增加，體重降低，伴有流產(chǎn)現(xiàn)象，總胎數(shù)和活胎數(shù)均有不同程度的減少，多成為死胎或吸收胎；與對(duì)照組比較，胎盤重量和胎盤系數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，模型組孕鼠隨攻蟲天數(shù)的增加，胎盤的損傷程度逐漸加大；胎盤細(xì)胞凋亡數(shù)量也隨著攻蟲時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。說(shuō)明牛源犬新孢子蟲感染對(duì)孕鼠胎盤具有一定的病理性損傷，主要對(duì)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的損害，影響胎盤的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和激素的合成，致使胎兒生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、死產(chǎn)、流產(chǎn)等現(xiàn)象的發(fā)生。
　　3、牛源犬新孢子蟲感

5、染孕鼠胎盤相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè)
　　本試驗(yàn)以建立的牛源犬新孢子蟲孕鼠感染模型為研究對(duì)象，檢測(cè)孕鼠胎盤細(xì)胞懸液中IFN-γ、IL-4及TGF-β含量。結(jié)果表明，在孕鼠胎盤細(xì)胞懸液的檢測(cè)中，模型組孕鼠隨攻蟲天數(shù)的增加IFN-γ和IL-4濃度均有不同程度的波動(dòng)，但整體傾向于不利胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的方向發(fā)展。尤其模型組孕鼠TGF-β濃度隨攻蟲天數(shù)的增加逐步上調(diào)，已嚴(yán)重影響胎兒的正常生長(zhǎng)發(fā)育。
　　4、牛源犬新孢子蟲感染孕鼠胎盤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白

6、檢測(cè)
　　本試驗(yàn)以牛源犬新孢子蟲感染孕鼠模型為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)孕鼠胎盤組織中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2及TNF-α表達(dá)情況。結(jié)果表明，Bax、TNF-α的表達(dá)上調(diào)和Bcl-2表達(dá)量下調(diào)，可能啟動(dòng)內(nèi)、外源性的細(xì)胞凋亡途徑，使胎盤細(xì)胞凋亡增加，致使胎盤缺氧、缺血，導(dǎo)致胎兒流產(chǎn)、早產(chǎn)。
　　5、牛源犬新孢子蟲感染孕鼠胎盤激素檢測(cè)
　　本試驗(yàn)采用ELISA法檢測(cè)牛源犬新孢子蟲感染后孕鼠血清中CRH、ACH、

7、CG、PL及E3等激素含量變化，以此確定牛源犬新孢子蟲感染后對(duì)孕鼠胎盤功能和胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的影響。結(jié)果顯示，牛源犬新孢子蟲感染孕鼠在妊娠中期血清中CRH、ACH、CG、PL及E3等胎盤激素含量均有顯著下調(diào)現(xiàn)象，而且在整個(gè)妊娠過程中模型組孕鼠隨攻蟲天數(shù)的增加與對(duì)照組比較，5種胎盤激素均出現(xiàn)了顯著性波動(dòng)變化，這種相互作用、相互影響的變化是牛源犬新孢子蟲感染所致孕鼠胎盤組織病理?yè)p傷和滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡增加的病理生理基礎(chǔ)。而這些激素含量顯著變化的結(jié)果

8、必然導(dǎo)致不良妊娠現(xiàn)象的發(fā)生。
　　結(jié)論：
　　1、本試驗(yàn)成功建立了牛源犬新孢子蟲感染 BALB/c孕鼠模型，確定了每個(gè)模型小鼠的攻蟲劑量為105個(gè)蟲體。
　　2、牛源犬新孢子蟲感染孕鼠的胎盤重量和胎盤系數(shù)與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)牛源犬新孢子蟲感染對(duì)孕鼠胎盤具有一定的病理性損傷，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞破壞，影響胎盤對(duì)胚胎所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和胎盤激素的合成。
　　3、牛源犬新孢子蟲感染孕鼠隨攻蟲天數(shù)的增加，孕

9、鼠胎盤細(xì)胞懸液中IFN-γ、IL-4及TGF-β濃度整體傾向于不利胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的方向發(fā)展。
　　4、牛源犬新孢子蟲感染孕鼠胎盤組織中Bax、TNF-α的表達(dá)上調(diào)和Bcl-2表達(dá)量下調(diào)，可能啟動(dòng)內(nèi)、外源性的細(xì)胞凋亡途徑，使胎盤細(xì)胞凋亡增加，致使胎盤缺氧、缺血，導(dǎo)致胎兒流產(chǎn)、早產(chǎn)。
　　5、牛源犬新孢子蟲感染孕鼠在妊娠中期血清中CRH、ACH、CG、PL及E3等激素含量的顯著下調(diào)，是牛源犬新孢子蟲感染所致孕鼠胎盤組織損傷和細(xì)胞凋